ERK1-2-Runx2信號(hào)通路介導(dǎo)周期性張應(yīng)力作用下牙周膜成纖維細(xì)胞成骨分化的機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：
　　正畸治療過程中，牙齒在正畸力的作用下發(fā)生移動(dòng)，其生物學(xué)基礎(chǔ)在于牙周組織在應(yīng)力刺激下發(fā)生改建。正畸力經(jīng)牙齒傳遞到牙周組織，牙周膜在這一過程中發(fā)揮了橋梁作用。牙周膜成纖維細(xì)胞(periodontal ligament fibroblasts，PDLFs)是牙周膜的主要構(gòu)成細(xì)胞，在應(yīng)力刺激下能合成細(xì)胞因子并通過胞內(nèi)信號(hào)傳遞系統(tǒng)影響細(xì)胞行為（增殖，分化，凋亡等），從而介導(dǎo)牙周組織的改建，修復(fù)和再生。研究應(yīng)力刺激在PDLF

2、胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及對(duì)PDLF行為的影響，對(duì)于闡明正畸力作用下牙周組織改建的分子機(jī)理，發(fā)現(xiàn)有利于促使牙齒移動(dòng)的力學(xué)環(huán)境都具有重要意義。
　　成骨細(xì)胞是促進(jìn)骨基質(zhì)分泌和礦化的主要細(xì)胞。核心結(jié)合因子a1(corebinding factor a1，Cbfa1)，又稱Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt related transcription factor2，Runx2)，是學(xué)者們公認(rèn)的最重要的成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子之一。Runx2蛋白能

3、特異性結(jié)合許多成骨基因啟動(dòng)子上的順式作用元件，并促進(jìn)成骨靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。雖然Runx2基因和蛋白的表達(dá)水平在礦化組織和成骨細(xì)胞系中遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于一些非骨組織來源的細(xì)胞，但是目前越來越多的研究表明其基因和蛋白水平與成骨細(xì)胞的功能和分化并不是直接線性相關(guān)，而Runx2蛋白的活化狀態(tài)也是其發(fā)揮功能的重要影響因素。目前，學(xué)者們一致認(rèn)為Runx2是聯(lián)系胞外成骨誘導(dǎo)因素和胞內(nèi)影響成骨細(xì)胞功能分化的信號(hào)通路的樞紐。
　　細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(e

4、xtracellular signal regulated kinase1/2，ERK1/2)是最先被發(fā)現(xiàn)并且最具有代表性的有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase，MAPK)家族的成員。經(jīng)胞外刺激因素活化后的ERK1/2可以進(jìn)一步影響其下游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和活化。有研究表明Runx2是ERK1/2眾多下游靶基因中的一員，但是ERK1/2-Runx2通路是否可以在應(yīng)力刺激下的PDLF中被激活還

5、未知;如果其確實(shí)參與了應(yīng)力刺激下PDLF的成骨分化，其具體的分子機(jī)理也有待深入研究。
　　本研究首先通過攜帶Runx2基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的PDLF，探究Runx2對(duì)PDLF成骨分化的作用，然后構(gòu)建了PDLF體外培養(yǎng)-應(yīng)力刺激模型，觀察Runx2和其他相關(guān)成骨基因在應(yīng)力刺激下的表達(dá)變化，以及ERK1/2通路在應(yīng)力刺激下的激活情況;最后通過比較對(duì)正常PDLF和Runx2過表達(dá)PDLF實(shí)施應(yīng)力刺激，以及特異性阻斷ERK1/2通

6、路對(duì)應(yīng)力刺激PDLF成骨分化的影響，研究ERK1/2和Runx2在介導(dǎo)應(yīng)力刺激促進(jìn)PDLF成骨分化過程中發(fā)揮的作用，對(duì)應(yīng)力刺激，ERK1/2，Runx2，以及PDLF的成骨基因表達(dá)這幾個(gè)因素之間的關(guān)系進(jìn)行闡述，以明確ERK1/2-Runx2通路介導(dǎo)應(yīng)力刺激調(diào)控PDLF成骨分化的分子機(jī)理，為臨床正畸矯治提供新的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　方法及結(jié)果：
　　1、牙周膜成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定
　　采用組織塊聯(lián)合酶消化法對(duì)牙周膜

7、成纖維細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示角蛋白染色為陰性，波形絲蛋白染色為陽性，HE染色胞漿伊紅，胞核嗜堿性。成纖維細(xì)胞特異性表面蛋白1(FSP1)免疫熒光染色陽性。
　　2、穩(wěn)定過表達(dá)Runx2基因的PDLF的構(gòu)建及Runx2對(duì)PDLF的成骨誘導(dǎo)作用
　　利用Ⅱ型Runx2基因以及LV5慢病毒載體構(gòu)建LV5-Runx2慢病毒載體。有限稀釋法測(cè)定病毒液滴度為6x105TU/ml。通過靶細(xì)胞侵染預(yù)實(shí)

8、驗(yàn)對(duì)MOI值以及Puromycin篩選濃度進(jìn)行摸索，最終獲取穩(wěn)定過表達(dá)Ⅱ型Runx2的牙周膜成纖維細(xì)胞。熒光定量PCR以及Western Blot證實(shí)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LV5-Runx2的牙周膜成纖維細(xì)胞中Runx2的mRNA和蛋白水平都升高顯著。熒光定量PCR結(jié)果顯示Ⅱ型Runx2過表達(dá)可以有效促進(jìn)PDLF中成骨轉(zhuǎn)錄因子SP7，骨鈣素(OCN)和骨涎蛋白(BSP)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，但對(duì)1型膠原（COL-1）和堿性磷酸酶(ALP)的表達(dá)無影響，并且輕微

9、抑制轉(zhuǎn)錄激活因子4(ATF4)的表達(dá)。茜素紅染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)Ⅱ型Runx2過表達(dá)的PDLF體外培養(yǎng)3周后可以觀察到鈣結(jié)節(jié)。
　　3、周期性張應(yīng)力刺激體外培養(yǎng)的牙周膜成纖維細(xì)胞模型構(gòu)建
　　使用多通道細(xì)胞體外牽張應(yīng)力加載系統(tǒng)，對(duì)體外培養(yǎng)的牙周膜成纖維細(xì)胞施加振幅10％，頻率0.5HZ的周期性牽張力，加力作用時(shí)間為1h，3h，6h，12h，18h，24h，以不加力組作為對(duì)照組，采用熒光定量PCR測(cè)定并繪制成骨基因Runx2，SP7，

10、OCN，BSP和ATF4的mRNA隨加力時(shí)間延長(zhǎng)而變化的表達(dá)曲線;利用Western Blot和免疫沉淀法測(cè)定Runx2蛋白水平在不同加力時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)，以及Runx2和ERK1/2在不同加力時(shí)間的激活情況。結(jié)果證實(shí)了周期性張應(yīng)力可以促使牙周膜成纖維細(xì)胞中上述成骨基因的表達(dá)，并且在這一過程中同時(shí)伴隨Runx2和ERK1/2通路的磷酸化。
　　4、ERK1/2-Runx2通路介導(dǎo)了周期性張應(yīng)力刺激下牙周膜成纖維細(xì)胞的成骨分化
　

11、　對(duì)正常PDLF和過表達(dá)Runx2的PDLF分別進(jìn)行應(yīng)力刺激3h，熒光定量PCR結(jié)果顯示周期性張應(yīng)力刺激以及Runx2過表達(dá)對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞中成骨基因SP7，OCN和BSP的mRNA表達(dá)有協(xié)同促進(jìn)作用，即對(duì)Runx2過表達(dá)的PDLF同時(shí)施加應(yīng)力刺激比不加力的Runx2過表達(dá)PDLF或者加力的正常PDLF對(duì)上述成骨基因的轉(zhuǎn)錄刺激作用更強(qiáng)。對(duì)加力組PDLF同時(shí)應(yīng)用ERK1/2通路的特異性抑制劑U0126后，上述成骨基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平較單純

12、加力組有所下降。通過對(duì)正常PDLF和過表達(dá)Runx2的PDLF中Runx2的mRNA和蛋白水平的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)應(yīng)力刺激都可以誘導(dǎo)Runx2基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，但ERK1/2通路被抑制后，Runx2的mRNA水平顯著下降，而蛋白水平無明顯變化，說明應(yīng)力刺激對(duì)Runx2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)可以通過ERK1/2介導(dǎo)，但ERK1/2對(duì)Runx2蛋白的翻譯過程影響不大。通過測(cè)定Runx2的蛋白磷酸化水平(p-Runx2)，發(fā)現(xiàn)p-Runx2的表達(dá)趨勢(shì)與上述成骨基

13、因的表達(dá)趨勢(shì)高度一致，從而推測(cè)ERK1/2-Runx2通路介導(dǎo)應(yīng)力刺激對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞的成骨分化的機(jī)制在于提高Runx2蛋白表達(dá)水平的同時(shí)對(duì)其進(jìn)行磷酸化修飾以提高Runx2蛋白的轉(zhuǎn)錄激活功能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ERK1/2蛋白主要存在于胞漿中，而Runx2蛋白則存在于胞核中;應(yīng)力刺激激活ERK1/2后促使p-ERK1/2進(jìn)入胞核并與Runx2形成蛋白復(fù)合體，推測(cè)這為p-ERK1/2對(duì)Runx2的磷酸化修飾提供了條件;U0126抑制了應(yīng)力刺

14、激下ERK1/2的活化，從而阻止p-ERK1/2進(jìn)入細(xì)胞核并激活Runx2。
　　結(jié)論：
　　1.Runx2對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞的成骨分化具有促進(jìn)作用，可提高下游成骨靶基因SP7，OCN和BSP的轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。
　　2.周期性張應(yīng)力刺激可以促進(jìn)牙周膜成纖維細(xì)胞成骨基因SP7，OCN和BSP的轉(zhuǎn)錄表達(dá);Runx2基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平也同時(shí)升高，并伴隨Runx2蛋白和ERK1/2通路的磷酸化。
　　3.ERK

15、1/2-Runx2通路介導(dǎo)周期性張應(yīng)力刺激促進(jìn)牙周膜成纖維細(xì)胞成骨分化的機(jī)制在于提高胞內(nèi)Runx2蛋白的磷酸化水平(p-Runx2)，從而促進(jìn)Runx2下游成骨基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá);Runx2總蛋白水平與下游成骨基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)無相關(guān)性。應(yīng)力刺激激活ERK1/2進(jìn)入細(xì)胞核中與Runx2形成蛋白復(fù)合體，猜測(cè)這為p-ERK1/2對(duì)Runx2的磷酸化提供了條件;阻斷ERK1/2通路影響了應(yīng)力刺激對(duì)ERK1/2的激活以及入核，從而影響了Runx2蛋白的磷

16、酸化修飾和成骨基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
　　創(chuàng)新和意義：
　　本課題從細(xì)胞分子水平證實(shí)了ERK1/2-Runx2通路參與了周期性張應(yīng)力刺激下牙周膜成纖維細(xì)胞的成骨分化，并進(jìn)一步探討了其具體的機(jī)制，認(rèn)為Runx2的磷酸化水平的而非總蛋白水平在調(diào)控下游成骨靶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)方面起到至關(guān)重要的作用;而應(yīng)力刺激下活化的ERK1/2則在轉(zhuǎn)錄水平提高Runx2的表達(dá)并同時(shí)進(jìn)入細(xì)胞核與Runx2蛋白結(jié)合以促使Runx2蛋白的磷酸化。以上觀點(diǎn)為臨床正畸