應力對炎癥微環(huán)境下牙周膜細胞成骨能力的調(diào)控機制研究.pdf

1、目的：
　　近幾年由于固定矯治器美學性能的提高，正畸治療認識和社會接受性的增加，成人正畸治療需求呈現(xiàn)爆發(fā)性的增長。有確切的證據(jù)表明，年齡增大被認為和牙周炎的嚴重程度和患病率密切相關。牙周炎是一種以牙周組織炎癥及牙槽骨喪失為主要特征的慢性炎癥性疾病，表現(xiàn)為組織的修復和抵抗能力明顯下降，其原因可能是細胞的修復能力在炎癥微環(huán)境下受到抑制及破壞。因此正畸醫(yī)生將面臨一系列的新挑戰(zhàn)尤其是其中的部分患者存在牙周疾病。但是不幸的是，牙周炎患者正畸

2、治療的風險及其中的相關機制卻鮮有報道，其分子機制依舊尚未知曉。研究炎癥微環(huán)境下生物力學對牙周組織的骨改建機制具有重要作用。本研究以人牙周膜細胞(human periodontal ligament cells，hPDLCs)為研究對象，通過建立炎癥環(huán)境下hPDLCs體外應力加載模型，研究張應力對炎癥微環(huán)境下hPDLCs生物學行為影響及成骨能力的影響及機制，旨在闡明生物力學在特殊環(huán)境下的作用及相關機制，為正畸醫(yī)生能更好的理解成年牙周病患者

3、正畸治療風險和正畸力對炎癥狀態(tài)下牙周組織的作用提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　臨床上收集因正畸需要或者阻生原因拔除的前磨牙和第三磨牙，酶消化結合組織塊法培養(yǎng)hPDLCs，抗波形蛋白和抗角形蛋白免疫細胞化學染色鑒定hPDLCs來源。用IL-1β5 ng/mL和TNF-α10 ng/mL的外源性重組炎癥細胞因子培養(yǎng)hPDLCs構建炎癥環(huán)境，F(xiàn)lexcell-5000T細胞應力加載儀對hPDLCs施加以0.5Hz，12％ elon

4、gation的正弦曲線構建應力加載環(huán)境。實驗分為:空白組，炎癥組，加力組，炎癥加力組，持續(xù)性張應力刺激時間分別為12h、24h、48h，間歇性張應力刺激時間為1d和5d，每天4h。通過ELISA檢測應力狀態(tài)下hPDLCs炎癥因子的產(chǎn)生量，MTT檢測應力及炎癥微環(huán)境對hPDLCs增殖的影響，進一步通過PCR、WB、ALP活性、礦化實驗檢測應力對炎癥微環(huán)境下hPDLCs成骨能力的影響。
　　結果：
　　1.a)酶消化結合組織塊法

5、成功培養(yǎng)出hPDLCs10例，免疫細胞化學染色鑒定示抗波形蛋白陽性，抗角蛋白陰性，PBS對照陰性，符合中胚層來源特征。b）hPDLCs空白組分泌IL-1β和TNF-α微乎其微，加力組上清的IL-1β和TNF-α隨時間遞增，持續(xù)性張應力加載在48h，間歇性張應力加載在5d表達達到峰值，但其分泌量相較于炎癥模型無影響。c）炎癥因子對hPDLCs的增殖有不同程度的抑制作用，應力在炎癥環(huán)境下對hPDLCs抑制作用有所加重。
　　2.a)炎

6、癥環(huán)境在早期（48h之內(nèi)）促進了hPDLCs RUNX2但是降低COL-Ⅰ的表達，晚期（5d之內(nèi)）抑制RUNX2的表達。兩種應力抑制了炎癥環(huán)境中hPDLCsRUNX2的表達并且降低到空白組之下，同樣的，應力抑制了炎癥環(huán)境中hPDLCsCOL-Ⅰ的表達。b）兩種應力顯著降低了炎癥環(huán)境中hPDLCs的ALP活性，分別在48h和5d處，抑制最顯著。c）茜素紅染色及定量結果顯示，炎癥微環(huán)境中加載持續(xù)性應力使其礦化能力顯著降低。
　　結論：

7、
　　1.兩種類型的張應力能刺激hPDLCs分泌炎癥因子，并具有時間依賴性，但其分泌的炎癥因子量較炎癥模型微乎其微。炎癥環(huán)境中張應力對hPDLCs增殖具有顯著的抑制作用。
　　2.炎癥因子IL-1β和TNF-α在早期增加了RUNX2的表達但是降低了COL-Ⅰ的水平，提示牙周膜組織中骨形成和基質(zhì)沉積包含了不同的機制。炎癥微環(huán)境中加載張應力，RUNX2和COL-Ⅰ的表達水平顯著降低。此外，我們在ALP活性和礦化實驗中也發(fā)現(xiàn)了類似