大豆疫霉中參與氧化壓力應(yīng)答和致病過程的轉(zhuǎn)錄因子PsHSF1和PsBZPc32的功能分析.pdf

1、疫霉菌隸屬于茸鞭生物界卵菌門，與真菌的遺傳距離相距甚遠，大多數(shù)生化途徑、侵染機制、結(jié)構(gòu)特征都與真菌存在顯著的差別，這導致許多傳統(tǒng)殺真菌劑不能有效地用于疫霉病的防治。從分子水平上對疫霉菌的致病機制進行研究是尋找針對疫霉菌的新殺菌劑作用靶標和設(shè)計植物疫病控制策略的重要理論基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)錄因子是基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵因子，參與病原菌生長發(fā)育、應(yīng)答各種外界脅迫和致病等過程。隨著越來越多的疫霉菌基因組測序完成，尋找疫霉菌特異的轉(zhuǎn)錄因子，解釋其對疫霉菌

2、生長發(fā)育和致病的作用機理，對認識這類獨特的病原生物，篩選控制這類病原菌的新殺菌劑作用靶標具有重要意義。本研究以大豆疫霉為研究對象，期望通過挖掘大豆疫霉中調(diào)控致病過程和外界脅迫應(yīng)答過程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，研究其調(diào)控機制，揭示卵菌發(fā)育與致病的分子機理，為新型卵菌殺菌劑的研發(fā)提供獨特的分子靶標。
　　主要研究內(nèi)容如下:
　　大豆疫霉熱激轉(zhuǎn)錄因子HSF家族基因的鑒定及轉(zhuǎn)錄分析:熱激轉(zhuǎn)錄因子(HSFs)是細胞應(yīng)答熱激脅迫和多種化學刺激的信

3、號傳遞鏈上的終端組分，它們通過識別熱激元件(HSE)特異調(diào)節(jié)靶標基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而對逆境做出應(yīng)答。通過生物信息學分析對大豆疫霉、橡樹疫霉和致病疫霉的全基因組數(shù)據(jù)庫中含有HSF DNA結(jié)合域的基因序列進行挖掘，從三個疫霉種中鑒定到大量HSF編碼基因（17～24個），發(fā)現(xiàn)其數(shù)目遠遠高于真菌中HSFs，而與綠色植物中的相近。本文首先對疫霉菌基因組中編碼HSF轉(zhuǎn)錄因子的基因model進行了校正。通過序列、基因組結(jié)構(gòu)和進化等分析，發(fā)現(xiàn)疫霉中HS

4、Fs在基因組上具有成簇排列的特征。不同疫霉種間的同源基因序列相似性高，而與動物、植物和真菌中的同源基因進化距離相距甚遠，因此在進化樹上自成一支。推測疫霉屬的HSFs數(shù)量的擴增是由該分支共同的祖先基因在基因組中不斷復制而來的。此外，還利用實時定量RT-PCR對大豆疫霉中所有HSF編碼基因在無性生活史、侵染各個階段以及氧化壓力條件下的轉(zhuǎn)錄水平進行分析，發(fā)現(xiàn)HSFs存在多樣化的轉(zhuǎn)錄模式。這為尋找壓力應(yīng)答相關(guān)的HSF轉(zhuǎn)錄因子提供方向，并為尋找潛

5、在的大豆疫霉殺菌劑靶標提供了理論基礎(chǔ)。
　　HSFs參與調(diào)控大豆疫霉氧化壓力應(yīng)答和抑制植物防衛(wèi)反應(yīng):活性氧在植物防衛(wèi)反應(yīng)中扮演著十分重要的角色，而疫霉菌適應(yīng)這些植物產(chǎn)生的活性氧并進行應(yīng)答的機制目前尚不清楚。在大豆疫霉全基因組數(shù)據(jù)庫中搜索已報道的參與調(diào)控氧化應(yīng)壓力應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子的同源序列，并進行相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平分析，發(fā)現(xiàn)一個熱激轉(zhuǎn)錄因子PsHSF1在氧化壓力條件下和休止孢萌發(fā)階段顯著上調(diào)表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)大豆疫霉PsHSF1沉默轉(zhuǎn)

6、化子對氧化壓力耐受性降低，并且致病性受到嚴重影響。通過對侵染過程進行細胞學觀察，發(fā)現(xiàn)PsHSF1沉默轉(zhuǎn)化子在侵染大豆過程中不能抑制植物防衛(wèi)反應(yīng)所產(chǎn)生的活性氧的積累和侵染位點胼胝質(zhì)的形成;而外源添加還原劑GSH可促使活性氧積累量明顯減少，并且侵染菌絲在植物組織中擴展增加。通過對胞外酶活性檢測，發(fā)現(xiàn)PsHSF1沉默轉(zhuǎn)化子胞外氧化酶和漆酶的活性都明顯低于野生型。進一步對PsHSF1沉默轉(zhuǎn)化子中胞外氧化酶和漆酶編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)多

7、個基因轉(zhuǎn)錄水平受到影響。對其中一個漆酶編碼基因PsLAC4進行瞬時沉默，發(fā)現(xiàn)其對PsHSF1沉默所產(chǎn)生的表型有所貢獻。上述結(jié)果表明，PsHSF1可能通過調(diào)控胞外氧化酶相關(guān)編碼基因的表達而在抑制活性氧介導的植物防衛(wèi)反應(yīng)中起重要作用。
　　轉(zhuǎn)錄因子PsBZPc32在大豆疫霉生長發(fā)育及致病過程中的功能研究:bZIP(Basicleucinezipper)家族基因是一類在真核生物中普遍存在且極具序列多樣性的轉(zhuǎn)錄因子，它們在動物、植物、真菌

8、的生長發(fā)育和壓力應(yīng)答過程中起重要功能?；诒緦嶒炇抑皩Υ蠖挂呙筨ZIP轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)分析，從中篩選一個在侵染早期上調(diào)表達的基因PsBZPc32進行功能分析。PsBZPc32是大豆疫霉71個bZIP轉(zhuǎn)錄因子中唯一含有bZIP結(jié)構(gòu)域外其他功能域——PAS結(jié)構(gòu)域的蛋白。PsBZPc32沉默后導致大豆疫霉休止孢萌發(fā)率顯著降低和萌發(fā)后產(chǎn)生的微菌絲形態(tài)異常率增加。休止孢萌發(fā)產(chǎn)生的微菌絲極性生長受到影響，呈現(xiàn)多分枝的樹狀形態(tài)，并且其細胞壁表面多糖組

9、分分布異常。PsBZPc32突變體對大豆感病品種合豐47的致病力顯著下降，通過顯微觀察發(fā)現(xiàn)其能穿透寄主表皮，但是侵入的菌絲不能進一步擴展，并發(fā)現(xiàn)在植物侵染位點有大量活性氧積累。此外，還發(fā)現(xiàn)PsBZPc32沉默轉(zhuǎn)化子對過氧化氫的耐受性降低。上述結(jié)果表明，大豆疫霉PsBZPc32是一個參與侵染相關(guān)結(jié)構(gòu)發(fā)育、氧化壓力應(yīng)答和致病過程關(guān)鍵因子。
　　PsBZP32調(diào)控氧化壓力應(yīng)答和致病過程的分子機制研究:bZIP轉(zhuǎn)錄因子在真核生物生長發(fā)育過

10、程和應(yīng)答外界壓力過程的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著十分重要的功能。對大豆疫霉中參與侵染相關(guān)結(jié)構(gòu)的發(fā)育、致病過程和氧化壓力應(yīng)答過程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PsBZPc32，從其自身翻譯后水平調(diào)控和對下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控兩層面對其進行分子調(diào)控機制探索。通過磷酸化位點預測，發(fā)現(xiàn)PsBZPc32有多個潛在的磷酸化位點，并在大豆疫霉侵染3小時階段的磷酸化組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)其中的2個位點被磷酸化。在氧化壓力下條件下，PsBZPc32在細胞質(zhì)中出現(xiàn)多個磷酸化狀態(tài)，并且其定位

11、趨于從細胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移至細胞核中。對大豆疫霉侵染3小時階段磷酸化組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)兩個位點進行突變后進行亞細胞定位觀察，發(fā)現(xiàn)這兩個位點與PsBZPc32定位于細胞核密切相關(guān)。在PsBZPc32沉默轉(zhuǎn)化子中，發(fā)現(xiàn)多個效應(yīng)分子在侵染階段的轉(zhuǎn)錄水平與野生型中相比顯著降低。為了對PsBZPc32調(diào)控的下游基因有更全面的了解，將PsBZPc32沉默轉(zhuǎn)化子、過表達轉(zhuǎn)化子以及野生型菌株侵染3小時階段的樣品進行數(shù)字基因表達譜分析，發(fā)現(xiàn)有215個基因在沉默轉(zhuǎn)化子和