大豆疫霉GPCR-PIPKs基因家族及PsYKT6功能分析.pdf

1、大豆是世界上重要經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物,大豆疫霉(Phytophthora sojae)侵染大豆而引起幼苗猝死和成株的根腐病是世界大豆生產(chǎn)上的主要病害之一,每年給世界的大豆產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨額經(jīng)濟(jì)損失。大豆疫霉通過(guò)感受性激素、外界溫度、濕度及條件的變化而進(jìn)入不同的生活周期,在侵染寄主的過(guò)程中通過(guò)感知寄主而分泌大量的降解酶、壞死蛋白、蛋白酶抑制劑等效應(yīng)因子以達(dá)到成功侵染寄主的目的,因此研究大豆疫霉如何感受外界的信息及信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制、效應(yīng)因子的分泌機(jī)制可以為防止

2、病害的發(fā)生和擴(kuò)展提供理論依據(jù)。但由于傳統(tǒng)的、在其他生物中運(yùn)用成熟的基因敲除等分子遺傳操作技術(shù)不能運(yùn)用在大豆疫霉中,因此對(duì)大豆疫霉的生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律及致病性機(jī)理了解的相對(duì)較少。隨著大豆疫霉全基因組數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的不斷公布及完善,開(kāi)發(fā)一種快捷、易操作、高通量的基因功能研究技術(shù)平臺(tái)就顯得尤為重要。
　　 大豆疫霉中利用雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的基因沉默。dsRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默在真核生物中是普遍存在并且非常保守的一種降解靶標(biāo)基

3、因的機(jī)制。本研究將體外合成的dsRNA通過(guò)PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入大豆疫霉中從而介導(dǎo)目的基因的瞬時(shí)沉默,該技術(shù)不僅能利用單個(gè)dsRNA介導(dǎo)單個(gè)基因的沉默,更能夠?qū)⒉煌蚝铣傻膁sRNA同時(shí)介導(dǎo)多個(gè)內(nèi)源基因的同時(shí)沉默。在本研究中選擇了兩個(gè)目的基因作為研究的靶基因,分別為細(xì)胞循環(huán)調(diào)控基因PsCdc14(調(diào)控有絲分裂細(xì)胞循環(huán)的蛋白質(zhì)磷酸化酶)和一個(gè)無(wú)毒基因PsAvr3α(能被大豆抗病基因Rps3α所識(shí)別的RxLR效應(yīng)因子)。將體外分別

4、合成的PsCdc14和PsAvr3α dsRNA轉(zhuǎn)入大豆疫霉原生質(zhì)體后,再生的轉(zhuǎn)化子到第8天能夠觀(guān)察到轉(zhuǎn)化子內(nèi)源靶基因mRNA的減少；第9天到15天都表現(xiàn)出顯著的基因沉默現(xiàn)象,沉默效率在50％-95％之間；第17天,所有的沉默轉(zhuǎn)化子中內(nèi)源基因都恢復(fù)到正常轉(zhuǎn)錄水平。本研究針對(duì)PsCdc14和PsAvr3α的基因沉默均導(dǎo)致了良好的表現(xiàn)型,證明dsRNA介導(dǎo)的大豆疫霉基因瞬時(shí)沉默系統(tǒng)可以用來(lái)鑒定基因功能,其耗時(shí)短、效率高、高通量操作的特點(diǎn)加快

5、大豆疫霉功能基因組研究進(jìn)展。
　　 大豆疫霉G蛋白偶聯(lián)受體候選編碼基因的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及轉(zhuǎn)錄分析。G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptors,GPCR)是真核生物中普遍存在的一類(lèi)重要跨膜受體蛋白家族,通過(guò)感受外界信息后將信號(hào)傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi),從而激活細(xì)胞內(nèi)的一系列信號(hào)傳導(dǎo)途徑,并最終影響生物個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法方法從大豆疫霉、橡樹(shù)疫霉和致病疫霉的全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘出大量GPCR候選編

6、碼基因。對(duì)三種疫霉中GPCR候選基因之間進(jìn)行了同源性比較,分析了基因在基因組中的結(jié)構(gòu)特征。利用RNA-sequencing和qRT-PCR等技術(shù)分析了大豆疫霉中GPCR候選編碼基因在生活史及侵染各個(gè)階段的轉(zhuǎn)錄情況,為后續(xù)功能基因研究提供了思路,為大豆疫霉防治及新的藥物靶標(biāo)篩選提供了理論基礎(chǔ)。
　　 新型G蛋白偶聯(lián)受體PsPIPK4和PsPIPK10分別參與調(diào)控大豆疫霉的無(wú)性發(fā)育及有性生殖.游動(dòng)孢子具有趨化性的特點(diǎn),通過(guò)感受植物表

7、面產(chǎn)生的物理或化學(xué)信號(hào)來(lái)后接近寄主、休止、萌發(fā)從而成功侵染寄主。大豆疫霉有性生殖產(chǎn)生具有厚壁的卵孢子,可以抵抗外界的不良環(huán)境從而比營(yíng)養(yǎng)繁殖體存活的更久,同時(shí)卵孢子也是病害主要傳播手段,是病害流行的初侵染源。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)大豆疫霉的基因組中含有12個(gè)新型G蛋白偶聯(lián)受體,GPCR-PIPK家族,其C端為GPCR所具有的典型的7次跨膜結(jié)構(gòu),而在 N端具有磷脂酸肌醇激酶(PIPK)的結(jié)構(gòu)域。qRT-PCR結(jié)果顯示其中的一個(gè)編碼基因 PsPI

8、PK4在休止孢及休止孢萌發(fā)階段上調(diào)表達(dá).功能分析證明PsPIPK4沉默突變體游動(dòng)孢子的游動(dòng)速率變慢,并且很快休止,導(dǎo)致游動(dòng)孢子的趨化性喪失；休止孢的萌發(fā)顯著降低,導(dǎo)致游動(dòng)孢子的致病性減弱。另一個(gè)編碼基因PsPIPK10在無(wú)性發(fā)育及侵染階段都具有較高的轉(zhuǎn)錄量。功能分析證明PsPIPK10沉默突變體卵孢子產(chǎn)量急劇減少,所產(chǎn)的卵孢子量只有野生型菌株的1-5％。這也是在卵菌中第一次報(bào)道候選的GPCR編碼基因參與調(diào)控?zé)o性發(fā)育及有性生殖。
　

9、　 大豆疫霉SNARE蛋白家族生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及PsYKT6的功能分析。在真核生物中,膜泡運(yùn)輸參與了細(xì)胞體內(nèi)一系列的生理生化反應(yīng),這其中就包括調(diào)節(jié)細(xì)胞的極性生長(zhǎng)及一些外泌蛋白的分泌。SNARE(可溶性N-乙基馬來(lái)酰胺敏感因子附著蛋白膜受體)蛋白是真核生物細(xì)胞膜泡運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)生膜融合最重要的調(diào)控蛋白家族,在真核生物中非常保守。在本研究中,通過(guò)生物信息學(xué)方法在大豆疫霉基因組中預(yù)測(cè)到35個(gè)編碼SNARE蛋白的基因。利用轉(zhuǎn)錄譜RNA-seque