惡疫霉PcF-SCR效應分子編碼基因的轉錄特征、克隆和功能分析.pdf

1、由惡疫霉(Phytophthora cactorum)侵染引起的植物疫病是世界性分布的土傳毀滅性病害，危害超過200種植物，常給草莓、蘋果、梨、番茄和花卉等多種經(jīng)濟作物的生產(chǎn)帶來嚴重損失。近年來，我國以水果、蔬菜、花卉等為主的設施農(nóng)業(yè)得到快速發(fā)展，由惡疫霉引起的植物疫病對設施農(nóng)業(yè)的威脅也日趨嚴重。從疫霉菌與植物互作的角度出發(fā)深入了解疫霉菌致病的分子機理，可為新的殺菌劑作用靶標開發(fā)和植物疫病控制策略設計提供重要指導。
　　基于前期惡

2、疫霉轉錄組測序結果，本研究利用半定量RT-PCR技術首先分析了選取的32個致病相關基因在4個不同生長發(fā)育時期（菌絲、游動孢子囊、游動孢子和萌發(fā)休止孢）和侵染本氏煙階段（接種后1.5、3、6、12、24、48、96 h）的轉錄特征。結果顯示，13個基因在惡疫霉生長發(fā)育階段和侵染階段差異上調(diào)表達，其中包括8個PcF/SCR效應分子編碼基因。
　　通過高保真擴增技術將這13個效應分子編碼基因克隆到馬鈴薯X病毒(Potato virus

3、X,PVX)表達載體pGR107中，利用農(nóng)桿菌介導的基因瞬時表達法分析這些效應分子是否能夠引起植物細胞死亡(Plant cell death，PCD)。結果表明，4個PcF/SCR效應分子U866、U14169、U16448和U18031能夠在番茄上引起PCD，并且U866和U16448也能夠觸發(fā)本氏煙的PCD。另外激發(fā)素(elicitin)效應分子U7626和NLP效應分子U2101能夠觸發(fā)本氏煙的PCD，其中U7626也能夠在三生煙

4、上引起PCD。
　　為進一步明確PcF/SCR效應分子在惡疫霉致病過程中的作用，本研究首先建立了CaCl2-Polyethylene glycol(PEG)介導的惡疫霉原生質(zhì)體轉化方法以進行基因沉默分析。首先確定了惡疫霉對遺傳霉素G418的抗性篩選濃度，然后通過轉入外源的綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)基因對轉化方法進行驗證，通過在熒光顯微鏡下對轉化子及轉化子單孢純化株的菌絲進行觀察，發(fā)現(xiàn)

5、均發(fā)出綠色熒光，表明惡疫霉穩(wěn)定轉化體系的成功建立。然后，利用建立的穩(wěn)定轉化方法對PcF/SCR效應分子U866在惡疫霉中進行了基因穩(wěn)定沉默。結果顯示，與對照菌株相比，基因沉默轉化子對本氏煙的致病力顯著下降，對外源活性氧的敏感性顯著增強，表明該效應分子在惡疫霉與寄主植物的互作過程中發(fā)揮著重要作用。
　　本研究篩選獲得了8個惡疫霉PcF/SCR效應分子，明確了這些基因在惡疫霉生長發(fā)育和侵染階段差異上調(diào)表達的特征;克隆了基因全長序列;利