組織型纖溶酶原激活物DNA改組的探索研究.pdf

1、tPA(tissue-typeplasminogenactivator)是活性和特異性最強的一種溶栓藥物，但在體內短暫的半衰期很大程度上阻礙著該藥發(fā)揮應有的作用。本文設想更高活性的tPA能在一定程度上緩解這一矛盾。 DNA改組(DNAshuffling)技術的問世為人們獲得更高活性的基因表達產物提供了一個全新的技術平臺。然而，迄今為止DNA改組仍只限于對原核表達產物有活性的一組基因的改組，對那些只有真核表達才有活性的基因的改組，

2、由于篩選中存在的一系列困難而受阻。所以真核表達改組是人們努力的一個方向。本研究對這一技術在tPA分子定向進化中應用的可能性進行了探討，期望這一探索性結果能夠為后續(xù)幾輪的tPADNA改組探明道路，為最終從改組后tPA多樣性基因庫中篩選到比較理想的重組體打下基礎，也為其它需要以真核表達為基礎的DNA改組提供可借鑒的經驗。 首先采用RT-PCR方法獲得一組哺乳類動物tPA的cDNA基因，包括大白鼠、恒河猴、人的tPAcDNA。將這些基

3、因分別進行克隆、測序、原核與真核表達。測序結果表明恒河猴tPAcDNA編碼區(qū)(含信號肽)與發(fā)表的人tPAcDNA編碼區(qū)的核苷酸序列同源性為96％，由此所推導的氨基酸序列的同源性為97.5％。大白鼠tPAcDNA編碼區(qū)(含信號肽)與文獻發(fā)表的大白鼠tPAcDNA編碼區(qū)的核苷酸序列，除2個堿基不同外，其余完全相同，與發(fā)表的人tPAcDNA編碼區(qū)的核苷酸序列同源性約為80％(不含信號肽)，由此所推導的氨基酸序列的同源性為83％。本實驗所用的人

4、tPAcDNA由本室提供，是經基因突變改造過的第二代人tPA基因。將恒河猴、大白鼠、人tPAcDNA克隆于真核表達載體，轉染CHO細胞后表達出了有活性的tPA。培養(yǎng)上清檢測結果顯示人tPA在CHO細胞中表達產物的活性最高，恒河猴和大白鼠tPA的活性明顯低于人tPA的活性。將這三種tPA基因分別克隆于原核表達載體，結果表明原核表達產物幾乎沒有活性。 一個合適的表達篩選系統(tǒng)是DNA改組成功的關鍵。由于tPA只能在真核細胞中表達才有活

5、性，所以DNA改組后的篩選只能建立在真核表達的基礎上，這就意味著需要完成大量的探索性工作。本研究探索了DNA改組后的篩選途徑，建立了大規(guī)模tPA活性篩選檢測的方法。1.篩選途徑：就是建立在真核表達系統(tǒng)的基礎上，通過對單個細胞的克隆分離，實現(xiàn)篩選的第一步。真核表達中單個細胞克隆的獲得比原核表達中單菌落的獲得其難度和工作量要大得多。我們采用了稀釋細胞，96孔板克隆的方法，從中摸索出了一些可行的經驗和方法。2.篩選檢測方法：大規(guī)模篩選的檢測方

6、法也是DNA改組的關鍵。DNA改組后的篩選檢測方法不同于其他一些表達產物的檢測可用簡便的免疫學檢測方法，改組后的篩選必須要檢測表達產物的生物學活性，而且是大規(guī)模的檢測。傳統(tǒng)的tPA活性檢測方法是瓊脂平板法。該方法一次只能做幾份至幾十份的樣品，無法適用于改組后一次完成幾千至幾萬份樣品的檢測。我們將此方法進行了改良，建立了適用于tPADNA改組后大樣品量檢測的篩選方法。 在上述的基礎工作準備完成后，我們以人tPAcDNA、恒河猴及大

7、白鼠tPAcDNA為一組基因進行了tPA的改組(DNAfamilyshuffling)和篩選。篩選的結果和原先的設想有較大的距離，經過近20批次的改組和篩選，我們沒有篩選到活性明顯高于人tPA(經TNK優(yōu)化改構過)的克隆。我們只得到了兩株活性略高于人tPA的克隆，經RT-PCR、克隆、測序，證明為改組后的基因。再次轉染CHO細胞、96孔板克隆，挑選表達量最高的克隆，擴大培養(yǎng)后收獲上清、測其含量。與同樣獲得的人tPA表達上清比較它們之間的

8、活性。結果顯示兩株克隆的活性分別高于人的4倍和2倍。這一結果和其他一些蛋白活性物質改組后活性提高幾千至幾萬倍相距甚遠，也未達到我們設想的提高幾十至幾百的目標。雖然這是一項探索性的工作，而且只是第一輪改組的結果，但是最終獲得這一篩選結果仍不能令人滿意。導致這一結果的原因可能是：1.tPA的結構比較復雜，有多個二硫鍵，改組后易影響tPA的折疊，引起活性的降低。2.改組后基于真核細胞表達系統(tǒng)的篩選相對原核表達系統(tǒng)的篩選而言效率太低，其中包括真

9、核細胞的轉染效率和一次篩選的克隆數(shù)都遠不及原核。3.一個真核細胞可同時轉染進幾種不同的基因，而且一個基因表達量的高低又與其整合的位置有關，所以給篩選工作帶來了較大的困難，無法有效地從多樣性基因庫中篩選到高活性的基因。 篩選到的這兩株克隆序列測定結果表明，它們的序列以人和猴tPA的序列為主。和人tPA氨基酸序列(TNK)比較，其中一株克隆有16個氨基酸的差別，另一株有15個氨基酸的差別，有趣的是這一克隆有一88個氨基酸片段的缺失。

10、在這些變異中，多數(shù)的變異序列來源于恒河猴，個別變異來源于大白鼠tPA。同樣和恒河猴tPA氨基酸序列相比，多數(shù)的變異序列來源于人，個別變異來源于大白鼠tPA。 此外，本研究還嘗試了對人tPA進行進一步的改造。在原有第117位Asn突變成Gln的基礎上又將人tPA的第184，448的Asn突變成Gln，構建了含117、184二個突變點和含117、184、448三個突變點的兩種突變體。文獻報道此改造能提高tPA的活性，我們得到的結果表

11、明這二個糖基化位點和三個糖基化位點的同時消除并不影響tPA的活性，但是也未觀察到活性有所提高。針對tPA在體內的半衰期短這一問題，又將人IgG1Fc段基因與人tPA基因相連接，在CHO細胞中表達融合型的tPA，期望融合型的tPA能夠延長其在體內的半衰期。但是結果顯示，融合人Fc段的tPA其活性基本喪失。 一組基因經過第一輪DNA改組后不一定就能獲得活性非常高的克隆，往往要以前一輪改組后獲得的活性略高的幾個克隆為基礎進行下一輪的改