普羅布考與西洛他唑單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞組織型纖維溶酶原激活物和纖溶酶原激活物抑制劑-1的影響.pdf

1、目的:
　　 內(nèi)皮細(xì)胞是所有心血管危險(xiǎn)因素共同的靶點(diǎn),參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)各個(gè)階段均伴有血管內(nèi)皮功能障礙。血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠合成及分泌組織型纖溶酶原激活物(tissu eplasminogen activator,t-PA)和纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1),是體內(nèi)纖溶系統(tǒng)的重要組成部分。T-PA與

2、PAI-1的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)維持血漿纖溶系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)和纖溶系統(tǒng)與凝血系統(tǒng)的平衡起決定性作用。當(dāng)動(dòng)脈粥樣硬化時(shí),引起廣泛的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,受損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞合成t-PA能力減低,使血漿中PAI-1水平增高,過(guò)量的PAI-1與t-PA結(jié)合,使t-PA滅活,造成體內(nèi)纖溶活性降低,從而引發(fā)血栓的形成。
　　 普羅布考(Probucol,又名丙丁酚)是一種抗氧化劑,具有調(diào)脂、抗氧化、穩(wěn)定AS斑塊、改善內(nèi)皮功能等作用,西洛他唑(Cilostaz

3、ol)是一種新型抗血小板聚集藥物,臨床主要用于改善慢性動(dòng)脈閉塞癥引起的缺血性癥狀如潰瘍、肢痛、發(fā)冷及間歇性跛行等。兩藥在抗動(dòng)脈粥樣硬化、防治血管形成術(shù)后再狹窄等心血管疾病的治療方面已經(jīng)越來(lái)越引起人們的廣泛關(guān)注。
　　 本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞微環(huán)境角度來(lái)探討普羅布考和西洛他唑?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞t-PA與PAI-1的影響,進(jìn)一步明確普羅布考與西洛他唑的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)制,以及兩藥聯(lián)合應(yīng)用的協(xié)同效應(yīng)。
　　 材料與方法:
　　

4、一、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代
　　 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù),用含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱孵育,每日換液一次,2-3日傳代一次,用0.125%的胰蛋白酶消化細(xì)胞。
　　 二、大鼠腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定
　　 3-8天齡SD胎大鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。梯度篩網(wǎng)法收集腎血管球,反復(fù)貼壁法純化提取鼠腎臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞

5、(RMECs),用含20%優(yōu)質(zhì)胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行原代培養(yǎng),置于5%CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育。隔天換液一次,5～7d細(xì)胞呈單層密集生長(zhǎng)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至亞融合時(shí)即可傳代,用0.125%的胰蛋白酶消化細(xì)胞。用以下方法進(jìn)行鑒定:(1)形態(tài)學(xué)觀察:倒置相差顯微鏡下觀察原代細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)特性;(2)Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光法檢測(cè):一抗為兔抗鼠Ⅷ因子相關(guān)抗原(1:300),二抗為羊抗兔IgG一TRITC(1:100);(3)管腔樣結(jié)構(gòu)

6、實(shí)驗(yàn):觀察上述分離培養(yǎng)細(xì)胞能否在Matrigel上形成管腔樣結(jié)構(gòu)。
　　 三、實(shí)驗(yàn)分組
　　 分為對(duì)照組、劑量效應(yīng)組和時(shí)間效應(yīng)組;劑量組包括:西洛他唑0.3μmol/L、1μmol/L、3μmol/L、10μmol/L,普羅布考1μmol/L、3μmol/L、10μmol/L、30μmol/L,兩藥不同濃度相互配伍16組,分別作用細(xì)胞24小時(shí)收集培養(yǎng)上清液;時(shí)間組包括:西洛他唑1μmol/L、普羅布考3μmol/L、西洛

7、他唑1μmol/L+普羅布考3μmol/L分別作用細(xì)胞0、3、6、12、24、36小時(shí)收集培養(yǎng)上清液。
　　 四、雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)t-PA和PAI-1蛋白濃度
　　 人、鼠t-PA與PAI-1酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于美國(guó)R&D公司。用純化的抗體包被微孔板,制成固相抗體。向包被單抗的微孔中依次加入待測(cè)樣品(HUVECs和RMECs培養(yǎng)上清液)、生物素化的抗人或鼠t-PA與PAI-1抗體、辣根過(guò)

8、氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)標(biāo)記的親和素,置入37℃恒溫箱中溫育60分鐘,經(jīng)過(guò)徹底洗滌后用底物四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)顯色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值,計(jì)算樣品濃度。
　　 五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組均數(shù)比較用方差分析,相關(guān)性比較采用Pearson分析

9、方法,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 普羅布考濃度在(1μmol/L、3μmol/L、10μmol/L、30μmol/L)范圍內(nèi)以劑量依賴和時(shí)間依賴的方式降低HUVECs和RMECs中PAI-1合成與分泌,升高HUVECs中t-PA濃度及t-PA/PAI-1比值,同時(shí)增大RMECs中t-PA/PAI-1比值(P＜0.05或P＜0.01)。而對(duì)RMECs的t-PA濃度無(wú)明顯影響。
　　 西

10、洛他唑濃度在(0.3μmol/L、1μmol/L、3μmol/L、10μmol/L)范圍內(nèi)以劑量依賴和時(shí)間依賴方式抑制HUVECs和RMECs中PAI-1的合成與分泌,上調(diào)HUVECs中t-PA合成與分泌,同時(shí)升高HUVECs和RMECs中t-PA/PAI-1比值(P＜0.05或P＜0.01)。而對(duì)RMECs的t-PA濃度無(wú)明顯影響。
　　 與單獨(dú)作用組相比,普羅布考與西洛他唑聯(lián)合作用組HUVECs和RMECs中PAI-1濃度均

11、降低,t-PA/PAI-1比值均升高,HUVECs中t-PA濃度也升高(P＜0.05或P＜0.01),尤其是普羅布考30μmol/L+西洛他唑10μmol/L兩藥聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同效應(yīng)(析因分析中普*西P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1、普羅布考可不同程度地抑制HUVECs和RMECs合成及分泌PAI-1,促進(jìn)HUVECs合成及分泌t-PA,呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性。
　　 2、西洛他唑可不同程度地下調(diào)HUVE