組織型纖溶酶原激活物基因療法防治血管吻合口血栓栓塞

1、<p>　　組織型纖溶酶原激活物基因療法防治血管吻合口血栓栓塞</p><p>　　作者：張杏泉　王少東　范清宇　殷劍寧　裘秀春　張殿中 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 組織型纖溶酶原激活物 </p><p>　　關(guān)鍵詞: 組織型纖溶酶原激活物;基因療法;血管吻合口;血栓栓塞 </p><p>　　摘 要:目的 探討防止血管

2、吻合口血栓栓塞的新方法，了解組織型纖溶酶原激活物基因療法防止吻合口血栓栓塞的效果. 方法 ①將含有t-PA基因的重組質(zhì)粒pAdCMVt-PA與缺陷型腺病毒大框架pJM17 共轉(zhuǎn)染病毒包裝細胞293細胞，獲得有感染能力但復(fù)制缺陷的重組腺病毒AdCMVt-PA.②實驗動物隨機分為對照組和治療組，均用11-0尼龍縫線行大鼠頸總動脈原位端端吻合.治療組吻合口注射AdCMVt-PA溶液，對照組注射AdCMV（不含t-PA的空載體）.提取吻合口組

3、織的總RNA行RT-PCR，應(yīng)用發(fā)色底物法檢測吻合口組織的纖溶酶活力. 結(jié)果 治療組RT-PCR在2.0kb前面有一條帶，對照組則沒有.治療組術(shù)后第2，3，5，7和14日均可檢測到纖溶酶活力，但第3日活力最高，對照組未檢測到纖溶酶活力. 結(jié)論 克隆入腺病毒載體的t-PA基因可在吻合口組織中表達出有生物學活性的t-PA，可能有效地抑制吻合口血栓形成，提高吻合口通暢率. </p><p>　　Keywords:t

4、-PA gene;gene therapy;vascular anastomosis;thrombo-embolism </p><p>　　Abstract:AIM To develop a new way to prevent vascular anastomotic sites from thrombo-embolism and to study the effect of gene therapy wit

5、h tissue-type plasminogen activator（t-PA）gene on the formation of thrombo-embolism of vas-cular anastomotic sites.METHODS 1:Recombinant plas-mid pAdCMVt-PA was cotransfected into293cells with pJM17 ，and infectious but re

6、plication-deficient AdCMVt-PA was generated.2:Rats were randomly divided into control and treatment groups.11-0nylone medical suture was ap-pli</p><p><b>　　0 引言 </b></p><p>　　近年來，隨著血

7、管吻合技術(shù)的提高及顯微外科器械的完善，微小血管吻合的通暢率不斷提高，但不能達到百分之百，吻合口局部血栓形成仍是通暢率低的主要原因［1］ .臨床常用抗凝藥物來防治，但效果不理想［2］ ，所以有必要尋找一種局部抗凝法來提高通暢率.我們采用吻合口注射含抗凝血基因的真核表達載體AdCMVt-PA溶液，以探討局部基因療法對吻合口血栓栓塞的預(yù)防作用. </p><p><b>　　1 材料和方法 </b>

8、;</p><p>　　1.1 試劑、質(zhì)粒及實驗對象 RT-PCR試劑盒購自華美公司;t-PA發(fā)色底物法檢測試劑盒購自上海廣慈醫(yī)學高科技公司;質(zhì)粒pAdCMVt-PA本實驗室構(gòu)建;pJM17 質(zhì)粒和293細胞為本實驗室保存;Wistar大鼠24只，體質(zhì)量200～220g，隨機分為對照組和治療組各12只.293細胞用DMEM+100ml&#12539;L-1 小牛血清、青霉素100mg&#1253

9、9;L-1 和鏈霉素100mg&#12539;L-1 ，37℃，50ml&#12539;L-1 CO2 中培養(yǎng). </p><p>　　1.2 重組腺病毒的繁殖、純化和滴度測定［3，4］ 提取質(zhì)粒pAdCMVt-PA及pJM17 DNA，將兩者用磷酸鈣沉淀法共轉(zhuǎn)移至含有腺病毒E1區(qū)的293細胞中進行同源重組，得到腺病毒顆粒的粗提液.用此粗提液再感染293細胞，24h后收集細胞作PCR，確定陽性表

10、達克隆.再在293細胞中擴增腺病毒，用氯化銫密度梯度離心法制備純化的重組腺病毒，并進行透析處理.用噬斑分析法測定腺病毒滴度.分裝小管，-80℃保存?zhèn)溆? </p><p>　　1.3 重組腺病毒在吻合口局部治療實驗 將大鼠以10g&#12539;L-1 戊巴比妥鈉（40mg&#12539;kg-1 ）麻醉成功后，作頸部正中切口，解剖出雙側(cè)頸總動脈.用兩個血管夾（上、下相距約1mL）阻斷一側(cè)頸總動

11、脈后切斷之，修剪外膜，以11-0尼龍線作原位端端吻合，每個吻合口縫10針.于吻合口注入AdCMVt-PA（治療組）或AdCMV（對照組），10min后松血管夾.同法處理另一側(cè)頸總動脈. </p><p>　　1.4 目的基因轉(zhuǎn)錄水平的測定 術(shù)后12h，治療組和對照組各取2只大鼠，切取以吻合口為中心1cm長的血管.治療組、對照組血管組織各放一起，采用一步法提取組織總RNA，再行RT-PCR.PCR引物:P1:5’

12、-CG AAGCTT ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG3’HindⅢP2:5’-CG GGTACC TCA CGG TCG CAT GTT GTC ACG AAT3’BamHⅠ由上海Sangon生物工程有限公司合成. </p><p>　　1.5 目的基因表達產(chǎn)物的活性測定 分別于術(shù)后第2，3，5，7及14日隨機取治療組、對照組大鼠各2只，取出雙側(cè)吻合口，剝離結(jié)締組織，縱行剖開.以同組術(shù)后

13、同天數(shù)的吻合口組織為一份標本.每份標本行組織培養(yǎng)24h，收集上清，用發(fā)色底物法檢測t-PA活性. </p><p><b>　　2 結(jié)果 </b></p><p>　　2.1 確定陽性克隆 用磷酸鈣沉淀法將pAd-CMVt-PA及pJM17 DNA共轉(zhuǎn)移至293細胞中同源重組，將腺病毒顆粒粗提液再感染293細胞，24h后收集細胞作PCR，從而確定陽性表達克隆（Fi

14、g1）. </p><p><b>　　圖1 略 </b></p><p>　　2.2 腺病毒的制備 在293細胞進行同源重組得到具有感染能力且含有目的基因的腺病毒顆粒，經(jīng)擴增、純化，用噬斑法測定病毒滴度為5×109 pfu&#12539;mL-1 . </p><p>　　2.3 動物模型情況 兩組大鼠全部存活，切口

15、局部無感染、血腫及動脈瘤.切取吻合口標本時見全部血管吻合口均通暢、搏動好. </p><p>　　2.4 RT┐PCR產(chǎn)物電泳 治療組吻合口組織提取總RNA并RT-PCR，電泳，在2.0kb前有一條帶，與陽性對照pAdCMVt-PA的PCR產(chǎn)物t-PA（1.69kb）DNA長度一致;對照組無此帶.說明t-PA基因可在吻合口組織中轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA（Fig2）. </p><p><

16、;b>　　圖2　略 </b></p><p>　　2.5 t┐PA活性測定 治療組于術(shù)后第2，3，5，7及14日檢測的t-PA活性分別為:320，480，441，412和398IU&#12539;g-1 組織，說明t-PA基因可在吻合口組織中表達出有生物學活性的基因產(chǎn)物，表達量第3日最高，持續(xù)2wk以上;對照組則未檢測到纖溶酶活性. </p><p><b

17、>　　3 討論 </b></p><p>　　基因治療的關(guān)鍵在于將目的基因特異地導(dǎo)入靶組織或靶細胞內(nèi)，并確保導(dǎo)入的基因在宿主細胞內(nèi)能表達出有活性的蛋白質(zhì)［5］ .隨著分子生物學的發(fā)展，目前有兩種方法可將外源基因?qū)胙鼙?①先將外源基因?qū)肱囵B(yǎng)的內(nèi)皮細胞，然后回輸體內(nèi)使之貼附于血管壁［6］ ;②采用DNA重組技術(shù)，先構(gòu)建真核表達載體，再通過導(dǎo)管直接注入一段血管內(nèi).前者需體外培養(yǎng)細胞，費時易污染;

18、后者需用特制的球囊導(dǎo)管，且需阻斷血流一定時間.Flugelman［7］ 曾構(gòu)建了含報告基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并經(jīng)特制的球囊導(dǎo)管注入某段血管內(nèi)，但轉(zhuǎn)染的細胞數(shù)很低.究其原因，我們認為:逆轉(zhuǎn)錄病毒載體雖有能高效轉(zhuǎn)移并整合入宿主染色體及拷貝數(shù)恒定等優(yōu)點，但它只能感染分裂復(fù)制的細胞，而對高度分化、不分裂的細胞轉(zhuǎn)染效率較低甚至不能實施基因轉(zhuǎn)移. </p><p>　　血管內(nèi)壁由血管內(nèi)皮細胞構(gòu)成，因其直接與血液相接觸，故最先

19、被用于冠心病基因治療的靶細胞.但其屬分化成熟細胞，所以逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染率低.而腺病毒不但能感染復(fù)制分裂細胞，而且也能感染處于G0 期的非分裂復(fù)制細胞［8］ .更重要的是經(jīng)重組的腺病毒可直接用于在體細胞的轉(zhuǎn)染，不必將靶細胞從體內(nèi)取出，修飾后再回輸體內(nèi)等繁瑣勞動.因此，腺病毒載體最實用于心血管系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移.唯一缺點是腺病毒感染細胞時，其DNA不整合到宿主細胞染色體中［9］ ，從而影響目的基因的長期表達，但對于顯微小血管吻合后局部溶栓治療，表

20、達7～10d足以滿足需要. </p><p>　　1981年Rijken和Collen首次將組織型纖溶酶原激活物（t-PA）從Bowes黑色素瘤細胞培養(yǎng)上清中分離出來，并臨床應(yīng)用證實了其優(yōu)良的抗栓性能.1983年P(guān)ennica等人第一個克隆出t-PA cDNA全長，使得其基因治療成為可能.本研究國內(nèi)、外首次將含t-PA基因的腺病毒載體注入吻合口，并經(jīng)RT-PCR及t-PA發(fā)色底物法檢測，證實了t-PA基因?qū)胛呛?/p>

21、口血管壁中，并表達了有生物學活性的t-PA產(chǎn)物，第3日最高，可持續(xù)2wk以上.眾所周知，t- </p><p>　　PA對纖維蛋白有高度的特異性，兩者結(jié)合后構(gòu)象改 變，以致極易與纖溶酶原形成三聯(lián)復(fù)合物，使t-PA易激活纖溶酶，使纖維蛋白降解，達到溶栓目的［10］ .而血管吻合后，纖維蛋白易于吻合口局部沉積，t-PA是有選擇地在纖維蛋白表面活化纖溶酶原的.治療組血管吻合口組織表達了有活性的t-PA，這可能為防止血管

22、吻合口血栓栓塞提供了一種簡單實用的新方法，可望普及推廣. </p><p><b>　　參考文獻: </b></p><p>　?。?］Wieslaander JB，Aberg M，Dougan P.Acumulation of isotype labelled platelets in small arteries after end to end and end

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