口腔鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后標(biāo)記物及靶向藥物研究.pdf

1、研究背景：
　　口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）又稱(chēng)口腔鱗癌，是常見(jiàn)的發(fā)生于口腔頜面部的惡性腫瘤之一。盡管?chē)?guó)內(nèi)外目前對(duì)口腔鱗癌的流行病學(xué)調(diào)查和回顧性研究層出不窮。但對(duì)于河南省本地區(qū)的相關(guān)研究為數(shù)不多。加強(qiáng)對(duì)河南地區(qū)口腔鱗癌患者發(fā)病特點(diǎn)及生存率等因素的研究，有利于提高全省在口腔鱗癌治療中的總體水平。
　　microRNA（miRNA）是目前對(duì)于口腔鱗癌的研究熱點(diǎn)方向。研究證實(shí)

2、， miRNA這類(lèi)非編碼小RNA，是通過(guò)靶向、特異性作用mRNA或啟動(dòng)因子，導(dǎo)致靶RNA降解或者抑制其翻譯，降低相關(guān)靶基因蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而發(fā)揮重要的生理和病理調(diào)控作用。目前研究已發(fā)現(xiàn)，miRNA的異常表達(dá)與疾病尤其是癌癥有著密切的關(guān)系。癌癥進(jìn)展中的一個(gè)關(guān)鍵步驟是增殖失控。最近有證據(jù)顯示miRNA作為腫瘤癌基因或抑癌基因異常表達(dá)是影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的一個(gè)關(guān)鍵因素。在前期的基因芯片研究中我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)口腔鱗癌患者中miRNA-602的高表達(dá)趨

3、勢(shì)，并發(fā)現(xiàn)了EHMT1（常染色質(zhì)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶1）基因可以通過(guò)甲基化組蛋白從而在轉(zhuǎn)錄水平抑制MAL基因的表達(dá)，而miR-602可對(duì)已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)錄的 MAL mRNA進(jìn)一步發(fā)揮抑制作用， EHMT1/miR-602轉(zhuǎn)錄本通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平協(xié)同影響 MAL基因的穩(wěn)定性，從而對(duì)口腔鱗癌的轉(zhuǎn)移發(fā)揮調(diào)控作用。本研究擬對(duì)EHMT1在口腔鱗癌組織中的表達(dá)水平進(jìn)行探索，為口腔鱗癌的轉(zhuǎn)移尋找可靠的生物標(biāo)記物。
　　目前對(duì)于口腔鱗狀細(xì)胞癌的標(biāo)

4、準(zhǔn)化治療包括手術(shù)切除及隨后的輔助放療和化療。最近國(guó)內(nèi)外的研究在口腔鱗癌的綜合治療方面取得了一些進(jìn)展，但總體的預(yù)后情況仍然不太樂(lè)觀。新輔助化療（NACT）在口腔鱗癌治療中的作用，成為目前探索的重要領(lǐng)域。新輔助化療是指在實(shí)施局部治療方法（如手術(shù)或放療）前所做的全身化療，目的是使腫塊縮小、及早殺滅看不見(jiàn)的轉(zhuǎn)移細(xì)胞，以利于后續(xù)的手術(shù)、放療等治療[36-49]。其目的是減少手術(shù)切除的范圍，改善局部區(qū)域功能，控制和減少遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，從而降低死亡率和復(fù)發(fā)

5、率，改善治療結(jié)果。然而，新輔助化療在口腔癌中的適應(yīng)癥尚未明確定義，大多數(shù)研究未能顯示新輔助化療在可切除的口腔鱗癌中，對(duì)局部區(qū)域病變的控制和總體生存率的明顯影響。在一些對(duì)局部病變晚期和不可切除口腔鱗癌的病人的研究中，新輔助化療可以顯著的控制腫瘤的生長(zhǎng)，縮小病變的范圍并給手術(shù)切除創(chuàng)造機(jī)會(huì)。盡管這些研究闡述了新輔助化療對(duì)極晚期和不可切除的口腔鱗癌，遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和可切除性及預(yù)后功能的一些積極影響，但需要進(jìn)一步驗(yàn)證。目前臨床上主要通過(guò)氟尿嘧啶、順鉑、

6、阿霉素等藥物進(jìn)行化療治療，但這些藥物在發(fā)揮抗癌作用的同時(shí)易產(chǎn)生耐藥性，而且毒副作用很大。因此，急需找到一個(gè)新型的有效的抗腫瘤藥物以提高患者的生存率。砷劑（主要是亞砷酸鈉，NaAsO2）在血液系統(tǒng)腫瘤方法有較多的研究，在胃癌、肺癌等實(shí)體腫瘤中也有研究，但總體研究較少，且對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌的研究尚不明確。因此，本研究檢測(cè)亞砷酸鈉對(duì)體外培養(yǎng)的人口腔鱗狀細(xì)胞癌HN12細(xì)胞增殖凋亡的影響，并探討其機(jī)制，以期為亞砷酸鈉的臨床影響提供理論基礎(chǔ)。

7、　　第一部分：對(duì)河南地區(qū)461例口腔鱗癌患者的回顧性分析
　　目的：
　　通過(guò)對(duì)2007年至2012年在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科就診的口腔鱗癌患者的病例資料進(jìn)行搜集和整理，總結(jié)河南地區(qū)口腔鱗癌發(fā)病的特點(diǎn)。分析與口腔鱗癌發(fā)病及預(yù)后生存率和復(fù)發(fā)率相關(guān)的因素。為河南地區(qū)口腔鱗癌患者的治療方法選擇和復(fù)發(fā)的預(yù)防以及預(yù)后的評(píng)估提供參考。
　　方法：
　　搜集和整理2007年至2012年于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜面外

8、科住院手術(shù)治療的口腔鱗癌患者的病歷資料，用SPSS21.0，GraphPad6.0等統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)納入的患者病例資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分別統(tǒng)計(jì)患者的年齡、性別、地域、腫瘤分化程度、病理TNM分期等特點(diǎn)。研究對(duì)象為符合篩選條件的河南地區(qū)口腔鱗癌患者，對(duì)研究中涉及到的復(fù)發(fā)率分析采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。選擇α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，當(dāng)P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在對(duì)影響術(shù)后生存時(shí)間的因素的研究中，采用Kaplan-Meier生存分析法繪制生存

9、曲線，并使用Log-rank法對(duì)所得出的數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1河南地區(qū)461例口腔鱗癌患者的基本情況分析
　　在461名口腔鱗癌患者中男性280人，女性181人；發(fā)病年齡主要集中在50-79歲；鄭州市就診患者顯著高于其他地區(qū)患者，另外豫西北地區(qū)三門(mén)峽市、濟(jì)源市、鶴壁市、洛陽(yáng)市就診患者分布數(shù)量較少，相比而言豫東地區(qū)周口市、開(kāi)封市、商丘市就診患者分布相對(duì)較多；就診患者中，中-高分化的口腔鱗癌患者占大多數(shù)；從發(fā)病

10、部位上看，就診患者中舌，頰粘膜，牙齦發(fā)病率位列前三。
　　2.對(duì)95例河南地區(qū)口腔鱗癌患者的復(fù)發(fā)率及生存率分析
　　在前期研究中的461例患者中隨機(jī)選取95例符納入標(biāo)準(zhǔn)的病例進(jìn)行后續(xù)研究。觀察到這些患者的復(fù)發(fā)率和生存率研究中，年齡、腫瘤的臨床分期對(duì)生存率產(chǎn)生影響；研究中還觀察到腫瘤的分化程度和腫瘤的臨床分期對(duì)復(fù)發(fā)率可以產(chǎn)生影響；對(duì)于晚期（IV期）的患者而言輔助化療對(duì)患者的生存率存在影響；對(duì)于分化程度較低的口腔鱗癌患者輔助化療

11、對(duì)患者的復(fù)發(fā)率存在影響。
　　小結(jié)：
　　1河南地區(qū)口腔鱗癌患者發(fā)病特點(diǎn)
　　研究表明，口腔鱗癌在河南地區(qū)的分布存在地域差異。造成這一現(xiàn)象的原因可能主要有交通條件差異，各地市級(jí)醫(yī)院或基層醫(yī)院的醫(yī)療條件差異等。從本研究的結(jié)果中觀察到，河南地區(qū)口腔鱗癌的發(fā)病特點(diǎn)與全國(guó)基本相符。但在發(fā)病年齡段上，位于70-79歲的患者數(shù)量也尤為突出，而造成這一結(jié)果的具體因素還有待進(jìn)一步研究。在這些患者中分化程度較低的患者數(shù)量較少，這可能與B

12、roders/WHO組織學(xué)分級(jí)系統(tǒng)本身存在的固有缺陷有關(guān)。
　　2影響口腔鱗癌術(shù)后復(fù)發(fā)率的相關(guān)因素
　　本研究結(jié)果顯示，就研究所涉及的口腔鱗癌患者而言，年齡，性別對(duì)口腔鱗癌的復(fù)發(fā)率沒(méi)有影響。而在研究中觀察到，病理分級(jí)和臨床分期對(duì)口腔鱗癌的術(shù)后復(fù)發(fā)率存在影響。對(duì)于低分化口腔鱗癌的患者而言，化療對(duì)其術(shù)后復(fù)發(fā)率也存在著影響。
　　3影響口腔鱗癌術(shù)后生存率的相關(guān)因素
　　研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于口腔鱗癌患者而言年齡和腫瘤的臨床分期可

13、能是影響患者術(shù)后生存率的因素。高年齡組的患者術(shù)后生存時(shí)間低于低年齡組，I期患者的術(shù)后生存率高于IV期患者。研究同時(shí)還發(fā)現(xiàn)對(duì)于晚期（IV期）口腔鱗癌患者而言，接受化療有助于改善患者的術(shù)后生存率。提示我們對(duì)于晚期患者的輔助化療在晚期口腔鱗癌的治療領(lǐng)域仍然值得研究。
　　第二部分：EHMT1在口腔鱗癌組織中的表達(dá)
　　目的：
　　了解EHMT1在口腔鱗癌組織中的表達(dá)情況，探究EHMT1的表達(dá)與口腔鱗癌進(jìn)展的關(guān)系。
　　

14、方法：
　　利用SP免疫組化染色法，對(duì)前期研究的隨訪患者中隨機(jī)選取95名患者調(diào)取病理組織蠟塊，切片染色。結(jié)果判斷結(jié)合細(xì)胞計(jì)數(shù)法和光密度分析法。使用SPSS及GraphPad等統(tǒng)計(jì)軟件用t檢驗(yàn)和Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)及Kaplan-Meier生存分析法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：
　　1．根據(jù)EHMT1的免疫組化染色結(jié)果，95例口腔鱗癌患者的組織切片染色平均光密度（ Mean optical density，M

15、OD）值在34.53~167.38之間。取中位數(shù)119.86。將患者分為兩組：EHMT1低表達(dá)組，即MOD值小于119.86的患者；EHMT1高表達(dá)組，即MOD值大于等于119.86的患者。采用Kaplan-Meier生存分析法用GraphPad6.0繪制生存曲線，并使用Log-rank法對(duì)所得出的數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)。P=0.0385<0.05，結(jié)果表明EHMT1低表達(dá)組患者的生存率高于EHMT1高表達(dá)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2．

16、根據(jù)患者的腫瘤轉(zhuǎn)移情況將患者分為轉(zhuǎn)移組（metastasis）和非轉(zhuǎn)移組（non-metastasis），對(duì)兩組患者的EHMT1表達(dá)情況進(jìn)行分析，用t檢驗(yàn)驗(yàn)證兩組的MOD值是否存在差異。結(jié)果為：P=0.007<0.05，這說(shuō)明兩組患者的EHMT1表達(dá)存在顯著差異。
　　3．根據(jù)第一部分研究中的臨床病理參數(shù)分組后得出不同參數(shù)的陽(yáng)性率。運(yùn)用Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)檢測(cè)各參數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果顯示晚期口腔鱗癌患者的EHMT1表達(dá)

17、與早期患者相比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。P<0.05
　　小結(jié)：
　　1．EHMT1在口腔鱗癌中的表達(dá)對(duì)患者術(shù)后生存率存在影響，患者EHMT1表達(dá)水平與其術(shù)后生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。
　　2．EHMT1在口腔鱗癌中的表達(dá)對(duì)患者腫瘤轉(zhuǎn)移存在影響，患者 EHMT1表達(dá)水平與其腫瘤轉(zhuǎn)移率呈正相關(guān)。
　　3．晚期患者的EHMT1陽(yáng)性率與早期患者相比存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示EHMT1的表達(dá)可能與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)。
　　第三部分：亞砷

18、酸鈉抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖、促凋亡及機(jī)制研究
　　目的：
　　利用CCK8法、Annexin V/PI雙染法及Western blot等方法探討亞砷酸鈉調(diào)控Wnt信號(hào)通路對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖及凋亡的影響。
　　方法：
　　1．25、2.5、5、10、20μmol/L的亞砷酸鈉處理人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株HN12，24、48、72h后，CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖；0、10μmol/L的亞砷酸鈉處理HN12細(xì)胞48h后，

19、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western blot檢測(cè)Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表達(dá)；后續(xù)實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、亞砷酸鈉組、激活劑+亞砷酸鈉組，各組細(xì)胞處理48h后，CCK8實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)及Western blot分別檢測(cè)三組細(xì)胞的增殖、凋亡及Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1．隨著時(shí)間及濃度增加細(xì)胞抑制率均顯著升

20、高，具有時(shí)間和濃度依賴(lài)性（P<0.05或P<0.01），根據(jù)IC50選擇10μmol/L的亞砷酸鈉作為后續(xù)研究；
　　2．10μmol/L的亞砷酸鈉組細(xì)胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表達(dá)顯著高于0μmol/L組，β-catenin、Cyclin D1蛋白表達(dá)顯著低于0μmol/L組（P<0.01）；
　　3．亞砷酸鈉組及激活劑+亞砷酸鈉組細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞抑制率及 Cleaved caspase3蛋白表達(dá)均顯著

21、高于對(duì)照組，β-catenin、Cyclin D1蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組（P<0.01）；
　　4．激活劑+亞砷酸鈉組細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞抑制率及Cleaved caspase3蛋白表達(dá)均顯著低于亞砷酸鈉組，β-catenin、Cyclin D1蛋白表達(dá)顯著高于亞砷酸鈉組（P<0.01）。
　　小結(jié)：
　　1．研究證明亞砷酸鈉能夠抑制HN12細(xì)胞的增值同時(shí)促進(jìn)其凋亡。
　　2．經(jīng)過(guò)亞砷酸鈉處理的HN12細(xì)胞其凋亡相關(guān)

22、蛋白Cleaved caspase3表達(dá)升高，而Wnt信號(hào)通路相關(guān)的β-catenin、Cyclin D1蛋白表達(dá)降低。
　　3．激活Wnt信號(hào)通路后亞砷酸鈉的促凋亡作用受到抑制。
　　結(jié)論：
　　1．河南地區(qū)口腔鱗癌的發(fā)病特點(diǎn)及患者術(shù)后的生存率和復(fù)發(fā)率與國(guó)內(nèi)發(fā)達(dá)地區(qū)相關(guān)報(bào)道情況大致相同。表明我省的口腔鱗癌的治療水平處于全國(guó)前列。
　　2．EHMT1在口腔鱗癌中的異常表達(dá)，特別是在轉(zhuǎn)移性患者癌組織中的高表達(dá)提示E