環(huán)氧合酶-2與口腔鱗狀細(xì)胞癌關(guān)系的初步研究.pdf

1、目的: 口腔鱗狀細(xì)胞癌(oralsquamouscellcarcinoma，OSCC)是最常見(jiàn)的口腔惡性腫瘤，約占口腔癌總數(shù)的80％以上，發(fā)病率高，生存率低，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。研究表明，口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展不僅存在細(xì)胞的過(guò)度增殖，同時(shí)也存在細(xì)胞凋亡的抑制，凋亡和增殖的平衡失調(diào)在癌癥發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)是前列腺素(prostaglandin，PG)生物合成過(guò)程中一個(gè)重要的限速

2、酶，可將花生四烯酸(arachidonicacid，AA)代謝為各種前列腺素產(chǎn)物，從而參與機(jī)體的病理生理過(guò)程。近年來(lái)的研究表明，COX-2除了在炎癥中發(fā)揮重要作用外，還與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。COX-2促進(jìn)腫瘤發(fā)生的機(jī)制之一，可能通過(guò)其下游生成的PGE2上調(diào)VEGF等血管生成因子的表達(dá)，進(jìn)而參與腫瘤新生血管生成有關(guān)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是一種高度特異性的血

3、管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂因子，通過(guò)與其特異性受體(VEGFR)結(jié)合，引起一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，釋放多種細(xì)胞與生長(zhǎng)因子，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)新生血管生成，在腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中起重要作用。 該實(shí)驗(yàn)應(yīng)用環(huán)氧合酶-2抑制劑NS-398處理人舌鱗癌細(xì)胞系Tca8113，研究其體外抗增殖作用及其對(duì)細(xì)胞周期的影響，并且檢測(cè)環(huán)氧合酶-2及VEGF對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞凋亡發(fā)生過(guò)程及新生血管生成的調(diào)節(jié)作用，借以探討環(huán)氧合酶-2與口腔鱗狀細(xì)胞癌的關(guān)系，為

4、進(jìn)一步研究口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)理提供理論依據(jù)，為尋找更有效的口腔鱗癌治療方法提供新的思路。 實(shí)驗(yàn)材料與方法: 1.免疫組化收集口腔鱗癌組織標(biāo)本45例，白斑35例，正?？谇徽衬?2例，使用免疫組化S-P法，觀察COX-2及VEGF的表達(dá)。 2.VEGFmRNA及蛋白含量的表達(dá)檢測(cè)經(jīng)150μmol/LNS-398處理的人舌鱗癌細(xì)胞Tac8113中VEGFmRNA及蛋白的含量變化。 3.細(xì)胞培養(yǎng)Tca8113

5、細(xì)胞系用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃，5％CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞形態(tài)變化。 4.MTT檢測(cè)法Tca8113細(xì)胞以0.5×104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)液濃度為：含25、50、75、100、125、150、200μmol/LNS-398的培養(yǎng)液，對(duì)照組細(xì)胞為含0.1％DMSO的培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液(5m/ml)試劑20μl，37℃繼續(xù)孵育4小時(shí)，終止培養(yǎng)，每孔加入DM

6、SO150μl，震蕩10min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570nm處測(cè)定每孔吸光度值(OD)。 抑制率(％)=(1-處理組OD值/對(duì)照組OD值)×100％5.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 (1)倒置相差顯微鏡取含0、150μmol/LNiS-398的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h、72h、96h后于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞大體形態(tài)改變并照相;(2)透射電鏡培養(yǎng)細(xì)胞用胰酶消化后，PBS洗兩次，1000rpm，4℃，6’離心，2.5％戊二醛固定用于透射電鏡觀察。

7、 6.流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)基中，用含0、150μmoL/LNS-398的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48-96h，收集貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，PBS洗2次，加入碘化丙啶(PI)溶液，避光4℃作用20-30min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果用細(xì)胞周期分析軟件(ModFitLT3.0)進(jìn)行分析。 7.RT-PCR取150μmol/LNiS-398作用的人舌鱗癌細(xì)胞Tca8113培養(yǎng)72小時(shí)后，檢測(cè)其凋亡相

8、關(guān)基因Bcl-2、bax、survivinmRNA水平的變化。 8.WesternBlot印跡分析樣品采用考馬斯亮藍(lán)法定量蛋白，檢測(cè)150μmol/LNS-398作用的人舌鱗癌細(xì)胞Tca8113中凋亡相關(guān)基因Bcl-2、bax、survivin蛋白水平的變化。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1.COX-2、VEGF在鱗癌及白斑中的表達(dá)口腔鱗癌及白斑組織中細(xì)胞胞漿及胞膜中均有COX-2、VEGF的表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度在高分化鱗癌中最強(qiáng)，依

9、次為中分化鱗癌、低分化鱗癌、白斑，正?？谇徽衬ぽp微表達(dá)。采用方差分析，各組間差異具有顯著性(F=147.53，P＜0.001)。 2.VEGFmRNA及蛋白的含量表達(dá)150μmol/LNS-398作用的人舌鱗癌細(xì)胞Tca8113VEGFmRNA及蛋白的含量隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降(F=23.26，P＜0.001，F(xiàn)=99.52，P＜0.0001)。 3.細(xì)胞培養(yǎng)人舌鱗癌細(xì)胞Tca8113經(jīng)NS-398處理后隨著用藥時(shí)間的

10、延長(zhǎng)和用藥濃度的增加，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)不規(guī)則，細(xì)胞間隙逐漸增寬，體積逐漸縮小。 4.MTT法NS-398對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞Tca8113的抑制作用呈劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。藥物濃度：F=16.88，P＜0.05；時(shí)間：F=199.44，P＜0.00l。 5.透射電鏡人舌鱗癌細(xì)胞Tca8113經(jīng)150μmol/LNS-398作用72小時(shí)后，電鏡下可見(jiàn)典型的凋亡細(xì)胞特征：染色質(zhì)邊聚、濃縮。 6.流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期COX-

11、2抑制劑NS-398可引起人舌鱗癌細(xì)胞Tca8113G0/G1期細(xì)胞的大量增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例數(shù)減少，阻滯細(xì)胞生長(zhǎng)于G0/G1期(P＜0.001)。 7.BT-PCR隨著COX-2抑制劑NS-398作用時(shí)間的延長(zhǎng)，人舌鱗癌細(xì)胞系Tca8113中凋亡相關(guān)基因Survivin和Bcl-2的mRNA表達(dá)水平逐漸降低，Bax表達(dá)逐漸升高，差異顯著(P＜0.001)。 8.Western印跡分析隨著COX-2抑制劑NS-

12、398作用時(shí)間的延長(zhǎng)，人舌鱗癌細(xì)胞系Tca8113中凋亡相關(guān)基因Survivin和Bcl-2的蛋白表達(dá)水平逐漸降低，Bax表達(dá)逐漸升高，差異顯著(P＜0.001)。 結(jié)論: 1.COX-2及VEGF在口腔鱗癌組織高表達(dá)，其表達(dá)的改變?cè)趶恼＝M織到上皮異常增生，再到鱗癌的轉(zhuǎn)變中有明顯差異。 2.口腔鱗癌組織中COX-2與VEGF表達(dá)呈顯著正相關(guān)。 3.選擇性COX-2抑制劑NS-398可使體外培養(yǎng)的人舌鱗癌

13、細(xì)胞Tca8113VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)水平下降，且呈時(shí)間依賴(lài)性。 4.選擇性COX-2抑制劑NS-398可抑制體外培養(yǎng)的人舌鱗癌細(xì)胞Tca8113的增殖，并具有時(shí)間和濃度依賴(lài)性。 5.選擇性COX-2抑制劑NS-398可以使體外培養(yǎng)的人舌鱗癌細(xì)胞Tca8113細(xì)胞阻滯于細(xì)胞周期G0/G1期。 6.選擇性COX-2抑制劑NS-398可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人舌鱗癌細(xì)胞Tca8113細(xì)胞凋亡。 7.COX-2