馬鈴薯Y病毒CP基因片段DsRNA原核表達(dá)及其誘導(dǎo)抗性.pdf

1、轉(zhuǎn)錄后基因沉默是植物自身抵抗植物病毒侵染的一種保護(hù)機(jī)制，實(shí)踐證明通過(guò)轉(zhuǎn)基因在植物體內(nèi)表達(dá)植物病毒的某個(gè)完整基因或者基因部分片段的雙鏈RNA(dsRNA)均能獲得高抗的轉(zhuǎn)基因植株。也有研究表明在植物體外表達(dá)或合成植物病毒某個(gè)完整基因的dsRNA，也能誘導(dǎo)植物提高自身對(duì)病毒的抗性。但在體外表達(dá)僅含有植物病毒部分基因片段的dsRNA，能否也能誘導(dǎo)植物的抗病性還未見報(bào)道。
　　 本研究以馬鈴薯Y病毒壞死株系CP基因?yàn)榛A(chǔ)，以L4440為

2、載體構(gòu)建了兩個(gè)含有部分PVYN-CP基因片段的dsRNA原核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株HT115(DE3)，獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)化體，誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生了相關(guān)的dsRNA，并對(duì)產(chǎn)生的dsRNA進(jìn)行了誘導(dǎo)抗病毒試驗(yàn)，主要結(jié)果如下:
　　 1、RT-PCR獲得了PVYN-CP全長(zhǎng)基因序列，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了含有PVYN-CP基因5'端264bp和中間253bp的反向重復(fù)兩個(gè)原核表達(dá)載體LL-LS-L4440和ML-MS-L4440;

3、　　 2、將其分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株HT115，獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)化體。含有ML-MS-L4440的轉(zhuǎn)化體經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了相應(yīng)的dsRNA，并通過(guò)在不同時(shí)間添加IPTG，確定了高產(chǎn)dsRNA的IPTG最佳誘導(dǎo)時(shí)期;通過(guò)比較不同的dsRNA提取方法，最終確定了LiCl沉淀法提取dsRNA比較理想。
　　 3、用表達(dá)dsRNA的滅活細(xì)菌液和dsRNA提純液及其100倍稀釋物處理煙草進(jìn)行攻毒的試驗(yàn)，結(jié)果證明表達(dá)dsRNA的滅活

4、細(xì)菌溶液和dsRNA提純液及其100倍稀釋物均能降低PVYN在煙草體內(nèi)的含量，減輕PVYN對(duì)煙草的為害，表明含有PVYN-CP部分基因片段的體外表達(dá)的dsRNA能夠誘導(dǎo)植物對(duì)病毒產(chǎn)生抗病性。
　　 上述結(jié)果證實(shí)利用轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，構(gòu)建含有部分植物病毒基因片段的原核表達(dá)載體，在特定的細(xì)菌菌株中誘導(dǎo)表達(dá)相應(yīng)的dsRNA，用其滅活的細(xì)菌溶液和dsRNA提純液處理煙草，可誘導(dǎo)植物的病毒的抗性，這為誘導(dǎo)植物抗病毒的策略的制定奠定了基礎(chǔ)