甘露寡糖誘導抗病反應初步研究及枯草芽孢桿菌甘露聚糖酶基因的克隆與表達.pdf

1、甘露寡糖是由2-10個葡萄糖、甘露糖分子構(gòu)成的甘露低聚糖。本研究利用甜瓜-白粉病病害體系檢測甘露寡糖的誘導抗病作用。結(jié)果證實甘露寡糖能降低白粉病的發(fā)生。經(jīng)甘露寡糖處理后的甜瓜葉片中幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶、多酚氧化酶、過氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶的活性均有不同程度的增強。其中幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶分別在第13d和16d達到最高峰，以后酶的活性逐漸下降至對照水平；而苯丙氨酸解氨酶的活性一直處于上升趨勢，后期(5-6d)最為明顯

2、；同時寡糖也明顯激發(fā)了多酚氧化酶和過氧化物酶活性。 β-甘露聚糖酶(EC3.2.1.78)是一類能夠水解含有β-1,4-D-甘露糖苷鍵的甘露寡糖、甘露多糖的水解內(nèi)切酶，可以將植物膠水解成由2-10個單糖分子構(gòu)成的甘露低聚糖。本研究從不同地區(qū)的土樣中分離到高產(chǎn)β-甘露聚糖酶的一株細菌Z-2，通過16SrDNA序列同源性分析及生理生化性狀測定將菌株Z-2鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。對粗酶性質(zhì)的初步研究證明

3、其酶穩(wěn)定pH范圍較寬，最適pH為6.0；在40-55℃酶活力保持穩(wěn)定，最適溫度為50℃，高于55℃酶活力迅速下降。酶解產(chǎn)物經(jīng)薄層層析證明為低聚糖，不含單糖。 通過粘粒pLARF-5構(gòu)建菌株Z-2的基因組文庫，通過PCR介導的篩選方法，從Z-2基因組文庫中獲得甘露聚糖酶基因man。以pET22b(+)為載體，構(gòu)建pET-NcoI3和pET-NdeI18兩種表達載體，E.coliBL21(DE3)為宿主菌，經(jīng)IPTG誘導，兩種載體都

4、成功的表達了man基因。pET-NcoI3的Man胞外活性是pET-NdeI18的2倍。為了增加胞外酶的產(chǎn)量，本文對培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、IPTG的誘導濃度、菌體的濃度4個因素進行了優(yōu)化，結(jié)果表明當采用TB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)，當菌體濃度達到OD600=0.75時，加入IPTG誘導4h，培養(yǎng)基中甘露聚糖酶的活力可達到55.33U/mL，顯著高于野生菌產(chǎn)生酶的活力。 由于野生型man基因在Pseudomonasfluorescens

5、2P24中不表達或表達量較低，通過遺傳改造野生man基因的起始密碼子，核糖體結(jié)合位點和信號肽，構(gòu)建出3個表達結(jié)構(gòu)，分別連接在穿梭載體pRK415上轉(zhuǎn)化Pseudomonasfluorescens2P24。活性測定結(jié)果表明，培養(yǎng)基中不加魔芋粉時Man誘導活性很低，加入后胞內(nèi)和胞外均誘導目的蛋白的積累，改造后的質(zhì)粒胞外活性為1.55U/mL，胞內(nèi)約為3.8U/mg。苗期生測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入man基因2P24菌株對煙草花葉病有一定的防病效果。