膽堿-聚乙二醇雙修飾蒿甲醚脂質納米粒的制備及其體內外藥效與初步靶向性研究.pdf

1、目的：
　　感染瘧原蟲的紅細胞會特異性表達生成新滲透性通道（NPPs），并在紅細胞膜上過表達膽堿轉運載體(ECCs）?；诖耍菊n題以膽堿-聚乙二醇衍生物（CD-PEG-SA）為修飾分子，構建粒徑＜80 nm的膽堿-聚乙二醇雙修飾蒿甲醚脂質納米粒（CD-PEG-ARM-NLC），以期靶向紅細胞膜上的NPP通道和ECC載體，達到長循環(huán)和靶向抗瘧的作用。制備并表征CD-PEG-ARM-NLC；考察其對約氏瘧原蟲（PyBY265）、惡性

2、瘧原蟲（Pf3D7）的體內外抗瘧活性；并通過包載熒光探針香豆素-6研究CD-PEG-NLC對感染紅細胞的靶向性。
　　方法：
　　1. CD-PEG-ARM-NLC的處方工藝考察
　　在前期工藝研究基礎上，采用高壓乳勻法制備CD-PEG-ARM-NLC，通過對CD-PEG-SA的加入方式、用量進行單因素考察，優(yōu)化制備處方。
　　2. CD-PEG-ARM-NLC的質量表征
　　對CD-PEG-ARM-NLC

3、的形狀、粒徑、Zeta電位、包封率、載藥量等理化性質進行表征，考察藥物的體外釋放特性，并進行體外溶血試驗。
　　3. CD-PEG-ARM-NLC的體外抗瘧活性評價
　　通過明膠沉降法從常規(guī)培養(yǎng)的Pf3D7中分離得到有/無knob結構的Pf3D7，以ARM為陽性對照，采用常規(guī)培養(yǎng)的、有/無knob結構的Pf3D7，應用SYBR Green I法，考察不同濃度的ARM、ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-AR

4、M-NLC對瘧原蟲增殖的抑制作用，以藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50）為指標考察其體外抗瘧活性。
　　4. CD-PEG-C6-NLC靶向性的初步考察
　　以香豆素-6（C6）為熒光探針，C6溶液為陽性對照，高壓乳勻法制備C6-NLC、PEG-C6-NLC、CD-PEG-C6-NLC。將熒光納米粒分別與體外培養(yǎng)的Pf3D7感染的紅細胞、在體PyBY265感染的瘧鼠紅細胞孵育，熒光顯微鏡下觀察熒光分布和強度。通過NPP通道和ECC

5、載體抑制試驗，比較不同納米粒組的熒光亮度，分析NPP通道和ECC載體對納米粒進入感染紅細胞的影響。
　　5. CD-PEG-ARM-NLC的體內藥效學研究
　　采用約氏瘧原蟲BY265感染小鼠模型，以溶劑組、三種空白納米粒組，不治療（空白）組為陰性對照，以ARM組為陽性對照，通過四天抑制試驗和28天治愈試驗考察ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-ARM-NLC三種納米粒的抗瘧活性。
　　結果：

6、　　1. CD-PEG-ARM-NLC考察后處方
　　CD-PEG-SA的加入方式為外加乙醇法，加入量為m膽堿/m混脂=19.24％（g/g）。考察后的處方組成為：GMS1.9286 g，MCT1.0714 g，RH401.2 g，ARM0.768 g， CD-PEG-SA0.5772 g，去離子水100 ml。
　　2. CD-PEG-ARM-NLC的質量表征
　　CD-PEG-ARM-NLC是均一、略帶藍色乳光的半

7、透明液體制劑，透射電鏡結果顯示納米粒呈類球形，粒徑分布均勻；測定平均粒徑為65.10±0.64 nm，多分散系數(shù)為0.186±0.004；Zeta電位為-24.47±1.01 mV；包封率為87.03%±0.71%；載藥量為11.62%±0.10%；在pH7.4的磷酸鹽緩沖液中72 h內體外累積釋放率為81.95%±0.85%，釋藥規(guī)律符合Weibull方程，t50為10.36 h；體外溶血試驗無紅細胞聚集及溶血現(xiàn)象。
　　3.

8、CD-PEG-ARM-NLC的體外抗瘧活性評價
　　SYBR Green I法測得ARM、ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-ARM-NLC對常規(guī)培養(yǎng)的Pf3D7的IC50值分別為4.28±0.05、3.69±0.07、3.22±0.05、2.68±0.05 nmol/L；對有knob結構的Pf3D7的IC50值分別為4.32±0.06、3.93±0.03、3.58±0.08、3.01±0.05 nmol/L；對

9、無knob結構的Pf3D7的 IC50值分別為4.27±0.06、3.34±0.07、2.81±0.08、2.12±0.09 nmol/L。
　　4. CD-PEG-C6-NLC靶向性的初步考察
　　熒光顯微鏡觀察結果顯示，納米?；静贿M入正常紅細胞，但可進入感染紅細胞，且能聚集于瘧原蟲周圍，而不是彌散于整個紅細胞；CD-PEG-C6-NLC組的熒光強度高于C6-NLC組和PEG-C6-NLC組；以上結果顯示CD-PEG-C

10、6-NLC對感染紅細胞有靶向作用。加入NPP抑制劑（呋塞米）可基本阻斷C6-NLC和PEG-C6-NLC進入感染紅細胞，但CD-PEG-C6-NLC仍可進入感染紅細胞；同時加入NPP抑制劑（呋塞米）和ECC天然底物（膽堿）方能基本阻斷紅細胞對CD-PEG-C6-NLC的攝取。
　　5. CD-PEG-ARM-NLC的體內藥效學研究
　　陽性對照組ARM尾靜脈注射的ED50值為0.266 mg/(kg·day)，ED90值為0

11、.945 mg/(kg·day)，ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-ARM-NLC的ED50值分別為0.245、0.233、0.228 mg/(kg·day)，ED90值分別為0.927、0.905、0.872 mg/(kg·day)，表明ARM制成納米粒后抗瘧活性有一定的提高。
　　結論：
　　采用優(yōu)化后處方制備CD-PEG-ARM-NLC，其粒徑、Zeta電位、包封率、載藥量、體外釋放特性和溶血試驗等