藥物性肝損傷體外篩選模型和何首烏致肝損傷的初步研究.pdf

1、藥物性肝損傷(Drug-induced liver injury, DILI)常常是藥物研發(fā)失敗、上市后被撤市或限制使用的主要原因之一。因此，無(wú)論是上市前還是上市后，對(duì)有肝損傷風(fēng)險(xiǎn)的藥物，建立有效、靈敏、特異的體外DILI篩選模型顯得尤為重要。
　　何首烏作為傳統(tǒng)補(bǔ)益類(lèi)中藥的一種，使用十分廣泛。藥物不良反應(yīng)數(shù)據(jù)顯示，它具有明顯的肝損傷風(fēng)險(xiǎn)。雖然國(guó)內(nèi)外近年來(lái)進(jìn)行了一些基礎(chǔ)性研究，但毒性成分目前仍不清楚。因此，需要對(duì)何首烏致肝損傷毒性

2、成分及其可能的作用機(jī)制進(jìn)行研究。
　　首先，開(kāi)展五種肝細(xì)胞體外模型的比較研究。選擇對(duì)乙酰氨基酚、卡馬西平、雙氯芬酸鈉、異煙肼、丙戊酸鈉、鹽酸胺碘酮、鹽酸四環(huán)素、利福平、依托泊苷、鹽酸拉貝洛爾、達(dá)那唑、雷公藤甲素、野百合堿和黃獨(dú)素B共14個(gè)藥物為DILI陽(yáng)性對(duì)照，鹽酸班布特羅、鹽酸丁螺環(huán)酮和丁溴酸東莨菪堿共3個(gè)藥物為DILI陰性對(duì)照，采用CCK-8細(xì)胞毒性篩選、高內(nèi)涵篩選和肝相關(guān)生化指標(biāo)篩選等方法，對(duì)L-02、HepG2、HepaR

3、G和hiHeps等四種人源肝細(xì)胞系和一種原代大鼠肝細(xì)胞(Primary rat liver cells，PRLs)進(jìn)行比較研究。結(jié)果表明，HepaRG肝細(xì)胞系鑒別DIIL藥物的能力最高，并依鑒別DILI藥物的能力將其排序?yàn)镠epaRG＞L-02＞HepG2=hiHeps＞ PRLs。HepaRG肝細(xì)胞在檢測(cè)氧化應(yīng)激、線粒體損傷以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等方面靈敏性較高，呈劑量依賴(lài)性，優(yōu)于其他四種肝細(xì)胞。在相關(guān)性分析和顯著性檢驗(yàn)中，谷草轉(zhuǎn)氨酶(Asp

4、artate aminotransferase，AST)、乳酸脫氫酶(Lactatedehydrogenase，LDH)、蘋(píng)果酸脫氫酶(Malate dehydrogenase，MDH)可同時(shí)反映雙氯芬酸鈉、鹽酸丁螺環(huán)酮和達(dá)那唑?qū)epaRG肝細(xì)胞的影響，提示可以作為探索DILI藥物的肝損傷相關(guān)生物標(biāo)志物。
　　其次，對(duì)何首烏致肝損傷成分進(jìn)行研究。一方面，我們對(duì)何首烏藥材進(jìn)行提取和分離，得到何首烏70％總醇提物和8個(gè)提取組分;另一

5、方面，選擇易于獲得的何首烏所含的16個(gè)單體成分作為研究對(duì)象。采用CCK-8細(xì)胞毒性篩選、UPLC-PAD含量測(cè)定以及肝相關(guān)生化指標(biāo)測(cè)定等方法，對(duì)何首烏70％總醇提物、8個(gè)提取組分和16個(gè)單體成分進(jìn)行毒性組分和毒性成分的研究。結(jié)果表明，第四組分(Fraction4,Fr.4)可能為何首烏致肝損傷的毒性組分，沒(méi)食子酸、白藜蘆醇、大黃素、大黃酸為何首烏中具有明顯細(xì)胞毒性的單體成分。結(jié)合L-02肝細(xì)胞損傷特征分析和含量分析，推測(cè)沒(méi)食子酸可能是何

6、首烏致肝損傷的主要成分之一。此外，谷氨酸脫氫酶（Glutamate dehydrogenase，GLDH）和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-Glutamyl transferase，γ-GT)都反映何首烏70％總醇提物和沒(méi)食子酸對(duì)肝細(xì)胞的損傷作用。
　　最后，對(duì)沒(méi)食子酸致肝細(xì)胞損傷的初步機(jī)理進(jìn)行研究。分別從細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、高內(nèi)涵篩選（活性氧、線粒體膜電位、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、中性脂代謝和鈣離子穩(wěn)態(tài)）、二維凝膠電泳技術(shù)結(jié)合分子生物學(xué)驗(yàn)證，探索沒(méi)食

7、子酸在不同劑量和不同時(shí)間下對(duì)HepaRG肝細(xì)胞損傷的機(jī)理。結(jié)果表明，沒(méi)食子酸對(duì)HepaRG肝細(xì)胞的細(xì)胞周期沒(méi)有顯著影響;沒(méi)食子酸呈劑量依賴(lài)性的誘導(dǎo)HepaRG肝細(xì)胞凋亡;沒(méi)食子酸呈劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性的誘導(dǎo)HepaRG肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、降低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平和鈣離子濃度，對(duì)線粒體膜電位和中性脂代謝沒(méi)有顯著影響;沒(méi)食子酸(0.5mM)在不同時(shí)間（24h和48h）處理HepaRG肝細(xì)胞，共篩選出11個(gè)差異蛋白，其中24h組有6個(gè)差異蛋白，4

8、8h組有5個(gè)差異蛋白。結(jié)合GO和Pathway分析，發(fā)現(xiàn)24h處理組主要集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中功能蛋白的折疊和加工方面，48h處理組主要集中在功能蛋白折疊加工、功能蛋白前體RNA核糖核酸的調(diào)控、炎癥過(guò)程、宿主防御等方面;分子生物學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶(Peptidyl-prolylcis-trans isomeraseA，PPIA)的蛋白表達(dá)一致性和基因水平表達(dá)的一致性，推測(cè)PPIA可能是沒(méi)食子酸潛在的調(diào)控靶點(diǎn)。
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