人參液泡膜水孔蛋白基因PgTIP1的克隆和功能研究.pdf

1、人參液泡膜水孔蛋白基因PgTIP1的克隆和功能研究 水孔蛋白屬于主要膜內(nèi)蛋白家族，是一種水分跨膜運(yùn)輸?shù)墓δ苄缘耐ǖ赖鞍?。植物?xì)胞的生長、發(fā)育與細(xì)胞內(nèi)的水分狀況密切相關(guān)，在生長發(fā)育過程中不同水孔蛋白在時(shí)空上的特異表達(dá)表明它們參與了植物生理活動(dòng)的方方面面。植物組織在體外培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)失去對外源激素的依賴性形成激素馴化細(xì)胞的現(xiàn)象，但目前為止激素馴化的生理機(jī)制尚未被揭示。我們在研究激素馴化人參細(xì)胞的生長機(jī)理時(shí)首次發(fā)現(xiàn)并克隆了在馴化細(xì)胞

2、中特異表達(dá)的人參液泡膜水孔蛋白基因PgTIP1，并對它的生理功能進(jìn)行了研究。本論文的工作分兩部分，第一部分是激素馴化人參細(xì)胞系的建立，第二部分是人參液泡膜水孔蛋白基因PgTIP1的克隆和功能研究。 激素馴化是指體外培養(yǎng)的植物細(xì)胞失去對外源生長因子需要的穩(wěn)定的可遺傳的特征，這種現(xiàn)象在胡蘿卜、煙草、馬鈴薯、甜菜、大豆等多種植物中有過報(bào)道。我們從依賴外源生長素和細(xì)胞分裂素培養(yǎng)的人參細(xì)胞系出發(fā)，通過馴化、篩選獲得了不依賴任何外源激素培養(yǎng)

3、的細(xì)胞系，并且細(xì)胞的生長狀態(tài)和生長速度與激素依賴細(xì)胞系相似。通過掃描電鏡進(jìn)行的細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果也表明兩類細(xì)胞的形態(tài)和大小均無明顯差異。人參總皂甙含量的測定結(jié)果顯示激素馴化人參細(xì)胞系的皂甙含量高于激素依賴細(xì)胞系，同時(shí)，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)的結(jié)果進(jìn)一步證明了皂甙合成關(guān)鍵酶鯊烯合成酶(SQS)和鯊烯環(huán)氧酶(SQE)基因在激素馴化人參細(xì)胞中的表達(dá)高于激素依賴的人參細(xì)胞，暗示了激素馴化人參細(xì)胞系可能具有更強(qiáng)的皂甙合成能力。由于外源

4、施加的激素類物質(zhì)會在一定程度上給培養(yǎng)物帶來毒副作用，因此培養(yǎng)激素馴化細(xì)胞對植物細(xì)胞工程的研究和發(fā)展具有重要的意義。 通過抑制差減雜交和cDNA文庫的篩選，我們發(fā)現(xiàn)并克隆了激素馴化人參細(xì)胞系中特異表達(dá)的液泡膜水孔蛋白基因PgTIP1。以激素馴化人參懸浮細(xì)胞為材料，對施加外源KT(0.25mgl-1)和2,4-D(1.5mgl-1)處理時(shí)PgTIP1的表達(dá)變化作檢測，實(shí)時(shí)(Realtime)熒光RT-PCR的結(jié)果表明，KT能夠顯著上

5、調(diào)PgTIP1的表達(dá)，而2,4-D處理則抑制了PgTIP1的表達(dá)，二者共同作用時(shí)PgTIP1表達(dá)也明顯受到了抑制，以上結(jié)果無論是在對植物細(xì)胞激素馴化機(jī)理的探討中還是在對水孔蛋白的研究中都是沒有報(bào)導(dǎo)過的。由于PgTIP1是首次克隆到的人參水孔蛋白基因，我們還從生物信息學(xué)和體外功能驗(yàn)證上對其進(jìn)行了進(jìn)一步確認(rèn)。PgTIP1的序列分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果均表明它具有水孔蛋白的特征性序列和結(jié)構(gòu)，爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)實(shí)驗(yàn)也證明了PgTIP1是一個(gè)功能性的水孔

6、蛋白。將PgTIP1與GFP融合表達(dá)對其進(jìn)行的定位分析表明它主要定位于液泡膜上。由于PgTIP1特異表達(dá)于不依賴外源激素培養(yǎng)的細(xì)胞中，我們推測它極有可能參與了植物細(xì)胞的生長發(fā)育。通過在擬南芥中過量表達(dá)人參液泡膜水孔蛋白基因PgTIP1，我們對它的生理功能作了初步研究。結(jié)果表明，過表達(dá)PgTIP1擬南芥的早期生長發(fā)育速度快于野生型擬南芥，主要表現(xiàn)在根的長度增加、葉細(xì)胞變大及開花時(shí)間早于野生型對照。另外，過表達(dá)PgTIP1擬南芥的種子大小和