家蠅MdMtn1和MdSERP1基因的克隆、表達(dá)與蛋白功能檢測(cè).pdf

1、家蠅是一種重要的資源昆蟲(chóng)，其幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)通常生活在腐敗物質(zhì)多、雜菌橫生的環(huán)境中，對(duì)不良環(huán)境有很強(qiáng)的適應(yīng)能力。金屬硫蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白都是重要的抗逆蛋白。了解家蠅抗逆蛋白的功能對(duì)了解其在不良環(huán)境下的生物抗逆機(jī)制有著重要意義。
　　 本文以家蠅幼蟲(chóng)為研究對(duì)象，研究?jī)?nèi)容主要分為以下5個(gè)部分：
　　 第1部分：通過(guò)RACE 技術(shù)從家蠅幼蟲(chóng)體內(nèi)克隆到1條家蠅金屬硫蛋白基因MdMtn1（GenBank 登錄號(hào)為GU289398）

2、，并對(duì)其核苷酸和編碼的蛋白序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析；
　　 第2 部分：以家蠅β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)分析了MdMtn1基因在鎘刺激不同時(shí)間和不同濃度時(shí)mRNA表達(dá)量的變化；
　　 第3 部分：構(gòu)建了家蠅MdMtn1基因的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌DE3 宿主菌體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了誘導(dǎo)表達(dá)，并檢測(cè)了重組菌拮抗重金屬鎘的能力；
　　 第4 部分：對(duì)家蠅內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白MdSERP1（contig

3、 481）基因及其編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并且利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)分析了家蠅幼蟲(chóng)MdSERP1基因在菌刺激和鎘刺激下mRNA表達(dá)量的變化；
　　 第5 部分：對(duì)家蠅MdSERP1基因進(jìn)行了原核表達(dá)，并對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行了純化，以純化后的DsbA-SERP1融合蛋白免疫新西蘭大白兔，制備了抗血清。
　　 研究結(jié)果如下：
　　 （1）家蠅MdMtn1基因序列全長(zhǎng)408 bp，包含1個(gè)123 bp的

4、開(kāi)放閱讀框，可編碼40個(gè)氨基酸殘基，其中半胱氨酸殘基10個(gè)，呈-C-X-C-方式排列。該金屬硫蛋白的理論分子量為3.8 kD，等電點(diǎn)為8.78。同源比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，家蠅金屬硫蛋白與黑腹果蠅Drosophila melanogaster和擬果蠅D. Simulans的金屬硫蛋白MtnA 氨基酸序列具有較高相似性（identity=69％）。
　　 （2）能使家蠅幼蟲(chóng)半致死的CdCl2濃度為30mmol/L，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明

5、，當(dāng)用30mmol/L的鎘誘導(dǎo)家蠅幼蟲(chóng)時(shí)，MdMtn1基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)，在誘導(dǎo)24 h后基因表達(dá)量高于未刺激時(shí)MdMtn1基因的表達(dá)量；而用不同濃度Cd2+刺激家4）家蠅MdSERP1基因含1個(gè)195 bp的開(kāi)放閱讀框，可編碼64個(gè)氨基酸；蛋白相對(duì)：經(jīng)金黃色葡萄球菌刺激后，MdSERP1基因M主菌中的蠅幼蟲(chóng)24 h后取樣，進(jìn)行定量發(fā)現(xiàn)，不同濃度Cd2+對(duì)MdMtn1基因的誘導(dǎo)程度不同，呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)CdCl2濃度為

6、10mmol/L，MdMtn1基因表達(dá)量最高。
　　 （3）利用原核表達(dá)載體pET-DsbA，成功實(shí)現(xiàn)了MdMtn1基因在大腸桿菌中的融合表達(dá)，獲得的融合蛋白DsbA-MdMtn1分子量為28.5 kD；為了進(jìn)一步了解MdMtn1是否具有重金屬鎘結(jié)合能力，將能表達(dá)金屬硫蛋白的DE3菌株涂布于含CdCl2的培養(yǎng)基上，結(jié)果證實(shí)表達(dá)MT的大腸桿菌耐受重金屬鎘的能力得到了顯著增強(qiáng)：當(dāng)CdCl2的工作濃度等于20mmol/L時(shí)，MT重組菌

7、的生長(zhǎng)狀況良好，而作為陰性對(duì)照的空載菌則不能生長(zhǎng)。
　　 分子量為7.15 kD，理論等電點(diǎn)為10.38，存在1個(gè)疏水區(qū)和跨膜區(qū)，大約在該蛋白的第36-58 位；不含信號(hào)肽。利用Conserved Domain Search 工具進(jìn)行的蛋白結(jié)構(gòu)功能域分析發(fā)現(xiàn)該蛋白屬于RAMP4蛋白超家族；同源比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同物種的SERP1序列的N-末端差異較大，而跨膜區(qū)所在的C-末端較為保守，并且除少數(shù)種類(lèi)外，SERP1氨基酸序列的長(zhǎng)度基本

8、上保持在64-66個(gè)氨基酸。
　　 （5）對(duì)家蠅幼蟲(chóng)進(jìn)行了菌刺激和鎘刺激實(shí)驗(yàn)的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)，刺激24 h后表達(dá)量達(dá)到最大值，之后其表達(dá)量開(kāi)始逐漸下降；在大腸桿菌刺激后的家蠅幼蟲(chóng)中，MdSERP1基因呈現(xiàn)先降低后又逐漸恢復(fù)的趨勢(shì)，在刺激后6 h時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)，在刺激36 h后， dSERP1基因的表達(dá)量較未刺激時(shí)有所升高，且差異顯著；鎘刺激對(duì)MdSERP1基因的誘導(dǎo)趨勢(shì)與MdMtn1基因類(lèi)似，最高表達(dá)量的濃度和時(shí)間以