驅(qū)動(dòng)蛋白Oocyte-G1基因的克隆與功能研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物發(fā)育過程中生殖系統(tǒng)分泌的多種細(xì)胞因子相互作用,形成一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò),對(duì)其發(fā)育起著調(diào)控作用。近年來,大量與生殖系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞因子相繼被發(fā)現(xiàn)。我們?cè)谘芯颗c小鼠卵巢發(fā)育相關(guān)基因的過程中,通過差異顯示PCR技術(shù)(DDRT-PCR),篩選到一個(gè)新的小鼠Kinesin超家族成員,命名為Oocyte-G1。該基因在不同年齡小鼠卵巢中具有差異表達(dá),其開放閱讀框?yàn)?997bp,編碼一個(gè)含有997個(gè)氨基酸、分子量約110kD的蛋白質(zhì),其mRN

2、A長(zhǎng)度約3.6kb,廣泛存在于小鼠卵巢、肺、腎臟、睪丸和大腦組織中。Oocyte-G1在小鼠卵巢中,主要分布于卵母細(xì)胞及其周圍的一些顆粒細(xì)胞中,在15、40日齡時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值,在5、10、20以及120日齡時(shí)低水平表達(dá)。
　　 為進(jìn)一步研究Oocyte-G1的功能,我們分別在體外和體內(nèi)進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。TUNEL與流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示:在細(xì)胞內(nèi)過量表達(dá)Oocyte-G1,能引起細(xì)胞凋亡率顯著增高。隨后以含有Oocyte

3、-G1外源表達(dá)片段的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒為載體,構(gòu)建了Oocyte-G1過表達(dá)小鼠模型,通過PCR與Southern blot技術(shù)篩選得到Oocyte-G1過表達(dá)小鼠。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明:雄性O(shè)ocyte-G1過表達(dá)模型小鼠生精小管內(nèi)的生殖細(xì)胞凋亡率也顯著增高。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)Ooyte-G1的過量表達(dá)還能延緩小鼠發(fā)育,表現(xiàn)為體型及內(nèi)部器官發(fā)育遲緩、生殖器官成熟時(shí)期推遲。導(dǎo)致雄性小鼠生殖腺發(fā)育遲緩,影響生精過程；雌性小鼠卵泡發(fā)育也受到影響,使6周齡小鼠不

4、能形成成熟卵泡。這種發(fā)育遲緩現(xiàn)象,在隨后的發(fā)育過程中能逐漸恢復(fù)。
　　 為探索Oocyte-G1功能的產(chǎn)生機(jī)制,我們使用免疫共沉淀方法對(duì)多個(gè)參與細(xì)胞增殖、凋亡或分化的細(xì)胞因子進(jìn)行了篩選,結(jié)果顯示Oocyte-G1能與Caspase-3相互結(jié)合。免疫熒光定位結(jié)果顯示,這種相互作用發(fā)生在細(xì)胞核的周圍區(qū)域。在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中過量表達(dá)Oocyte-G1,能引起Caspase-3的表達(dá)量顯著增加,而Oocyte-G1沉默會(huì)引起Caspas

5、e-3表達(dá)量顯著降低。另外在Oocyte-G1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠中,Caspase-3的表達(dá)量也顯著增高。
　　 綜上所述,我們篩選并克隆了一個(gè)小鼠Kinesin超家族的新成員基因,Oocyte-G1,并對(duì)其功能進(jìn)行了研究。上述結(jié)果均提示Oocyte-G1能通過作用于一些細(xì)胞凋亡因子而對(duì)凋亡過程具有一定促進(jìn)作用,并進(jìn)而影響了動(dòng)物發(fā)育過程。深入研究Oocyte-G1在細(xì)胞凋亡以及生殖發(fā)育過程中的作用,能加深我們對(duì)哺乳動(dòng)物生殖發(fā)育過程