葛根素通過ERK信號通路促進骨髓間質(zhì)干細胞成骨分化.pdf

1、目的:在體外擴增培養(yǎng)的過程中，探討不同濃度的葛根素對人骨髓間質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell)生物學特征的改變及成骨分化調(diào)控作用機制，從而為將來間質(zhì)干細胞和葛根素臨床應用提供一些理論依據(jù)。
　　方法:(1)分離培養(yǎng)骨髓間質(zhì)干細胞，采用全骨髓直接貼壁法。借助于形態(tài)特征、表面抗原標記等對其進行生物學特性鑒定。(2)運用MTT法檢測葛根素對骨髓間質(zhì)干細胞增殖能力和生長曲線的影響。采用衰老相關β

2、-半乳糖苷酶染色(SA-β-gal)，檢測不同濃度葛根素對骨髓間質(zhì)干細胞衰老的影響，堿性磷酸酶染色檢測不同濃度葛根素對骨髓間質(zhì)干細胞成骨分化，油紅O細胞化學染色檢測其成脂分化能力，流式細胞儀分析檢測其細胞凋亡情況，采用transwell遷移實驗檢測不同濃度葛根素對骨髓間質(zhì)干細胞遷移能力的差異，RT-PCR技術檢測ALP基因水平表達的差異，采用Western blot檢測不同濃度葛根素對骨髓間質(zhì)干細胞ERK蛋白表達的影響(3)采用Grap

3、hPad Prism5.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，當p＜0.05時，認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:(1)從骨髓組織中分離出一種長梭形細胞，經(jīng)純化后流式細胞儀鑒定符合間質(zhì)干細胞相應表面標志:CD29(+)，CD44(+)，CD90(+)，CD105(+)，CD34(-)及HLA-DR(-)。(2)不同濃度葛根素對骨髓間質(zhì)干細胞形態(tài)的改變，DAPI染核顯示，在對照組細胞核中DNA呈均一分布，而實驗組細胞核則呈現(xiàn)比較明顯的DNA點塊狀

4、聚集。(3)MTT檢測結(jié)果顯示，增殖能力隨著葛根素濃度增加而下降。流式細胞凋亡顯示，隨著葛根素濃度增加，凋亡細胞的數(shù)量也在增加，此外，transwell遷移實驗顯示，隨著葛根素濃度增加，細胞的遷移能力下降。(4)分化能力:成骨誘導14天，堿性磷酸酶染色顯示，與對照組相比，實驗組細胞誘導分化能力均隨葛根素濃度的增加而增加。(5)基因表達:RT-PCR顯示，與對照組細胞相比，實驗組ALP mRNA表達量表達上調(diào)。(6)western blo