多能性干細(xì)胞誘導(dǎo)與體外培養(yǎng)的初步研究.pdf

1、誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)是通過導(dǎo)入四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc等組合,使分化的體細(xì)胞進(jìn)行重編程從而獲得一類與胚胎干細(xì)胞具有相似特性的新細(xì)胞類型。由于iPS細(xì)胞同樣具備與胚胎干細(xì)胞類似的無限增殖、多向分化潛能以及自我更新維持等能力,利用病人自身細(xì)胞獲得的iPS細(xì)胞能減少免疫排斥反應(yīng),且它能夠很好的避開ES細(xì)胞面臨的倫理道德問題,因而iPS技術(shù)在動(dòng)物模

2、型的建立、藥物篩選以及疾病治療等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。為探討以耳聾病人體細(xì)胞誘導(dǎo)獲得iPS細(xì)胞的可行性,本論文開展了如下三個(gè)方面的研究:
　　1.小鼠MEF誘導(dǎo)成多能性干細(xì)胞技術(shù)體系優(yōu)化:探討通過一種低效的誘導(dǎo)體系,誘導(dǎo) P53基因敲除以及野生型的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞,獲得iPS細(xì)胞,進(jìn)而分析二者Dlk1-Dio3區(qū)基因表達(dá)差異,研究P53信號(hào)通路與Dlk1-Dio3區(qū)在體細(xì)胞重編程機(jī)制作用上可能存在的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果表明:以四個(gè)多潛

3、能性轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4以及c-Myc為組合,用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,介導(dǎo) P53基因全敲型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞,在一個(gè)低效的誘導(dǎo)體系下,獲得的小鼠細(xì)胞集落AP染色呈弱陽性,為不完全重編程的iPS細(xì)胞。而通過慢病毒載體介導(dǎo),能成功誘導(dǎo)P53+/-小鼠胚胎成纖維,獲得的iPS細(xì)胞,AP染色呈陽性。RT-PCR檢測(cè)到內(nèi)源多能性四因子Oct4、Sox2、Klf4及 c-Myc的表達(dá)。免疫熒光染色能檢測(cè)到多能性相關(guān)的細(xì)胞核、細(xì)胞膜蛋白O

4、CT4、NANOG和SSEA-1等的表達(dá)。
　　2.利用非整合Episomal質(zhì)粒誘導(dǎo)耳聾病人體細(xì)胞獲得多能性干細(xì)胞的初步研究:探討應(yīng)用非整合質(zhì)粒系統(tǒng)獲得病人iPS細(xì)胞的可行性。結(jié)果顯示:病人皮膚組織塊原代培養(yǎng)第7天,可觀察到大量細(xì)胞從人耳皮膚組織邊緣向外延伸,呈典型的成纖維細(xì)胞特征。利用非整合Episomal質(zhì)粒轉(zhuǎn)染病人耳皮膚成纖維細(xì)胞,電轉(zhuǎn)后第5天能明顯觀察到細(xì)胞的形態(tài)由原先的梭形慢慢變圓,第15天能觀察到一個(gè)孔中已出現(xiàn)大量不

5、規(guī)則的圓形或橢圓形扁平狀的細(xì)胞集落,能明顯與集落周圍的成纖維細(xì)胞區(qū)分開。取第3代次的人iPS細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色,可觀察到細(xì)胞集落被染成深紫色,表現(xiàn)為AP陽性,而對(duì)照飼養(yǎng)層細(xì)胞則未被著色,呈AP陰性。以人胚胎干細(xì)胞H9作為陽性對(duì)照組,取第3代的人耳皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)的iPS細(xì)胞,用小鼠、大鼠、兔子來源的OCT-4、NANOG、SSEA-3、SSEA-4、SSEA-1抗體作為一抗,經(jīng)過免疫熒光染色后觀察顯示:人iPS細(xì)胞表達(dá)人胚胎多能性

6、干細(xì)胞細(xì)胞核蛋白OCT-4、NANOG以及細(xì)胞膜蛋白SSEA-3、SSEA-4。未檢測(cè)到小鼠多能性干細(xì)胞特異性膜蛋白SSEA-1的表達(dá)。細(xì)胞用Hochest33342染細(xì)胞核,觀察到多能性核蛋白OCT-4、NANOG能與Hochest33342染的細(xì)胞核重合;而多能性細(xì)胞細(xì)胞膜特異性表達(dá)的SSEA-3、SSEA-4分布在Hochest33342染的細(xì)胞核周圍,呈網(wǎng)格狀分布;未能在 iPS克隆上觀察到小鼠多能性干細(xì)胞特異性的SSEA-1的

7、表達(dá)。證明了本實(shí)驗(yàn)電轉(zhuǎn)得到的iPS細(xì)胞來源于人耳皮膚成纖維細(xì)胞,并非小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。
　　3.通過在293T細(xì)胞、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)、人間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC)、人胚胎干細(xì)胞(人 ESC)等不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加Selleckchem公司生產(chǎn)的支原體去除試劑,最終確定該試劑的作用效果。
　　結(jié)論:以四個(gè)多潛能性轉(zhuǎn)錄因子OSKM為組合,用慢病毒載體比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體更容易誘導(dǎo)P53基因全敲型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞為i