豬脂肪干細(xì)胞源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的獲取與鑒定.pdf

1、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)的出現(xiàn),為突破家畜胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells,ESCs)研究瓶頸帶來(lái)了曙光,為獲取穩(wěn)定建系的家畜多能干細(xì)胞提供了一種可行的替代方案。遺憾的是,至今僅有極少數(shù)豬iPSCs能得到嵌合體后代或者核移植后代,并伴有高流產(chǎn)率、高死亡率和高畸形率等問(wèn)題。因而,如何獲得高質(zhì)量的豬iPSCs已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本研究探討了以豬

2、的脂肪干細(xì)胞(Adipose-derivedstemcells,ASCs)為源頭細(xì)胞開(kāi)展重編程,旨在從源頭細(xì)胞類型上進(jìn)一步優(yōu)化豬的體細(xì)胞重編程技術(shù)體系,以獲得安全、可靠的iPSCs系,為今后進(jìn)行iPSCs克隆豬生產(chǎn),豐富轉(zhuǎn)基因豬創(chuàng)制手段,或服務(wù)于人類iPSCs的安全性和有效性評(píng)價(jià)等奠定基礎(chǔ)。本研究共開(kāi)展如下試驗(yàn)。
　　試驗(yàn)一:源頭細(xì)胞——豬ASCs的分離培養(yǎng)和生物學(xué)特征鑒定。我們通過(guò)膠原酶消化法從28日齡的長(zhǎng)白豬皮下脂肪組織分離純

3、化出豬ASCs系,并進(jìn)行了全面的鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn):豬的ASCs擁有很強(qiáng)的增殖活力,顯著高于取自同一頭豬的耳源成纖維細(xì)胞(Ear fibroblasts,EFs);ASCs在體外能夠進(jìn)行長(zhǎng)期傳代培養(yǎng),但擁有較高的異倍體率,且會(huì)隨著傳代周期而逐步上升;ASCs表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞特異性標(biāo)記物CD44、CD90、CD29的比率依次為100％、96.5%、41.7%,而淋巴細(xì)胞標(biāo)志物CD45、內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31、成纖維細(xì)胞標(biāo)記物HLA-DR的比率

4、依次為0.148%、0.404%、0.08%,可忽略不計(jì),表明細(xì)胞純度很高;在體外合適的誘導(dǎo)條件下,ASCs縱向分化能夠產(chǎn)生油紅O染色陽(yáng)性的成熟脂肪細(xì)胞,橫向分化能夠產(chǎn)生茜素紅染色陽(yáng)性的成骨細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié);ASCs中OCT4、SOX2、C-MYC、KLF4、NANOG以及LIN28基因均有內(nèi)源性表達(dá),但除了KLF4基因的表達(dá)量略高于相同代次EFs之外,其余幾個(gè)重編程轉(zhuǎn)錄因子在ASCs中的表達(dá)量很低甚至不表達(dá);基因組DNA去甲基化中間產(chǎn)物5

5、-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5-hmC)在ASCs中的含量顯著高于相同代次的EFs(P<0.01)。上述結(jié)果表明,我們分離得到的豬ASCs系純度很高且具有可塑性;直接與重編程關(guān)聯(lián)的若干轉(zhuǎn)錄因子在ASCs中的本底表達(dá)水平很低;由于ASCs處于較低的甲基化修飾狀態(tài),從而有助于細(xì)胞多能性的重新獲得;ASCs的異倍體率較高,在使用前,需要對(duì)其進(jìn)行正常核型細(xì)胞株的篩選。
　　試驗(yàn)二:重編程豬ASCs,開(kāi)展

6、iPSCs獲取和生物學(xué)特征鑒定。在借鑒小鼠與人無(wú)飼養(yǎng)層細(xì)胞、無(wú)血清條件下產(chǎn)生iPSCs策略的基礎(chǔ)上,以ASCs為源頭細(xì)胞,利用攜帶OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC四個(gè)外源重編程轉(zhuǎn)錄因子的藥物可誘導(dǎo)(RevTet-On)型慢病毒表達(dá)系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行無(wú)異源細(xì)胞影響下的重編程。結(jié)果如下:在有飼養(yǎng)層細(xì)胞存在的條件下,就AP陽(yáng)性的ESCs樣克隆形成率而言,ASCs是EFs的6.28倍,而無(wú)飼養(yǎng)層細(xì)胞條件下,在AP陽(yáng)性的ESCs樣克隆形成率方面,

7、ASCs是EFs的6.33倍;豬iPSCs培養(yǎng)液中添加特異性抑制絲裂原活化蛋白激酶激酶(Mitogen-activated protein kinase/Extracellular signal-regulated kinasekinase,MEK)信號(hào)通路和糖原合成酶-3(Glycogen synthase kinase-3,GSK3)信號(hào)通路的兩個(gè)小分子化合物(2i,即PD0325901和CHIR99021)后,豬iPSCs呈現(xiàn)出小

8、鼠ESCs的形態(tài)與傳代培養(yǎng)特征;慢病毒感染后,ASCs的異倍體率有升高的趨勢(shì);ASCs來(lái)源的iPSCs克隆為AP陽(yáng)性,同時(shí)這些克隆也都表達(dá)干細(xì)胞特異性標(biāo)記物OCT4、SOX2、NANOG、SSEA-3以及SSEA-4;iPSCs中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子OCT4、NANOG、DNMT3B、TERT基因被內(nèi)源性激活,而其它的多能性基因LIN28、ESRRB、UTF1和DPPA5也被活化;iPSCs在體外能夠分化形成擬胚體,表達(dá)外、中、內(nèi)三個(gè)胚層的標(biāo)

9、記基因,體內(nèi)能夠產(chǎn)生畸胎瘤;iPSCs在培養(yǎng)過(guò)程中,直接撤除強(qiáng)力霉素(Doxycycline)后,iPSCs會(huì)迅速發(fā)生分化。上述結(jié)果表明,豬ASCs用于重編程的效率顯著高于EFs(P<0.01),而且無(wú)飼養(yǎng)層、無(wú)血清條件下,豬ASCs能夠被成功誘導(dǎo)為iPSCs;慢病毒介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)入可能導(dǎo)致iPSCs異倍體率上升;在重編程后期,2i處理能夠促進(jìn)ASCs經(jīng)過(guò)充分重編程而達(dá)到穩(wěn)定的多能性狀態(tài);在重編程過(guò)程中,形成的iPSCs已經(jīng)產(chǎn)生對(duì)外源重