牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的研究.pdf

1、體細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)技術(shù)的出現(xiàn)引起了全球廣泛的關(guān)注，其在體細(xì)胞重編程機(jī)理和再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用等方面的研究中具有不可比擬的價(jià)值和優(yōu)越性，并且避免了因使用胚胎干細(xì)胞而涉及到的倫理問(wèn)題。牛作為大家畜中的最重要物種，為人類提供了絕大多數(shù)的肉和奶制品，對(duì)其體細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞原理和技術(shù)進(jìn)行深入研究顯得尤其重要。本研究對(duì)牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(biPSCs)的制備方法和原理、生物學(xué)

2、特性等進(jìn)行系統(tǒng)的探討，以期推動(dòng)其他大家畜誘導(dǎo)多能性的研究。
　　 1.建立了無(wú)病毒介導(dǎo)生產(chǎn)牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法。
　　 研究結(jié)果顯示，本研究成功構(gòu)建兩個(gè)包含不同轉(zhuǎn)錄因子順序的質(zhì)粒載體pOSKM和pKMOS，并使用脂質(zhì)體法和電穿孔法介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兩種方法將所構(gòu)建質(zhì)粒載體成功轉(zhuǎn)染牛成纖維細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染12天后檢測(cè)到4轉(zhuǎn)錄因子內(nèi)源性表達(dá)；2i/LIF培養(yǎng)液對(duì)成纖維細(xì)胞早期重編程有重要作用，PD有效的抑制牛成纖維細(xì)胞MEK1

3、/2信號(hào)通路，CHIR顯著增加牛成纖維細(xì)胞的堿性磷酸酶(AP)活性；兩種方法轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在2i/LIF培養(yǎng)液中培養(yǎng)均可形成類iPS克隆。
　　 2.優(yōu)化和完善了牛多能干細(xì)胞誘導(dǎo)和培養(yǎng)體系。
　　 研究結(jié)果顯示，兩個(gè)不同轉(zhuǎn)錄因子順序的質(zhì)粒(pOSKM和pKMOS)對(duì)biPSCs的生產(chǎn)沒(méi)有顯著影響；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法無(wú)論從單細(xì)胞Sox2陽(yáng)性率還是從類iPS克隆形成率都顯著高于電轉(zhuǎn)染法(15.8% vs2.1%；63.7 vs23.4

4、，p<0.05)；胚胎和胎兒來(lái)源的細(xì)胞其轉(zhuǎn)染效率顯著高于成體細(xì)胞，而轉(zhuǎn)基因的胎兒細(xì)胞與成體細(xì)胞在轉(zhuǎn)染效率方面無(wú)顯著差異。在類iPS克隆形成率方面，胎兒成纖維細(xì)胞系BFF64(♂)顯著低于胚胎成纖維細(xì)胞系，但顯著高于其他所有細(xì)胞系，成年體細(xì)胞系與轉(zhuǎn)基因胎兒細(xì)胞系差異不顯著，胎兒成纖維細(xì)胞系最優(yōu)；玻璃材質(zhì)上培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染后細(xì)胞無(wú)論是克隆形成時(shí)間和AP陽(yáng)性克隆形成率都顯著優(yōu)于塑料材質(zhì)，8孔培養(yǎng)玻片出現(xiàn)克隆的時(shí)間最早，10 mm細(xì)胞爬片形成AP陽(yáng)性

5、克隆數(shù)量最多；轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)于飼養(yǎng)層或?qū)诱尺B蛋白處理的培養(yǎng)皿中，AP陽(yáng)性克隆形成率顯著高于其他組，而二者之間無(wú)顯著差別；低氧培養(yǎng)體系(5%O2)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，與正常20%O2培養(yǎng)體系比較，發(fā)現(xiàn)對(duì)biPSCs的生產(chǎn)沒(méi)有顯著影響。
　　 3.初步弄清了牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的生物學(xué)特性。
　　 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，biPSCs集落性生長(zhǎng)形成克隆，克隆隆起呈島狀，細(xì)胞亮度高，邊緣整齊光滑折光性強(qiáng)，細(xì)胞排列致密，無(wú)明顯細(xì)胞間隔，與牛類胚胎干

6、細(xì)胞克隆、小鼠ES/iPS克隆相似且為AP染色陽(yáng)性；RT-PCR結(jié)果表明biPSCs表達(dá)多能性標(biāo)志基因OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC、CDH1、NANOG、DPPA3、SALLA、SOCS3和ZFP42，且表達(dá)STAT3，但不表達(dá)外胚層干細(xì)胞特異性基因T-BRACHYURY、FGF5和LEFTY2；免疫組化染色結(jié)果顯示biPSCs表達(dá)表面抗原TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3和SSEA-4，但不表達(dá)SSEA-1，

7、并表達(dá)SOX2和OCT4蛋白；biPSCs具有端粒酶活性和正常染色體核型(60條)；biPSCs體外延時(shí)培養(yǎng)可以自發(fā)分化成類上皮細(xì)胞、類神經(jīng)細(xì)胞和類脂肪細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，體外懸浮培養(yǎng)可形成擬胚體，并能在體內(nèi)分化形成畸胎瘤。
　　 4.對(duì)牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞外源轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)模式及增值與凋亡性能進(jìn)行了研究。
　　 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后初期細(xì)胞重編程主要依靠轉(zhuǎn)錄因子外源表達(dá)來(lái)推動(dòng)，18天后biPSCs多能性的維持主要依靠轉(zhuǎn)錄

8、因子的內(nèi)源表達(dá)；EdU標(biāo)記細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在2i/LIF培養(yǎng)液中培養(yǎng)的過(guò)程中增殖率迅速下降，克隆形成前細(xì)胞遷移頻繁，細(xì)胞在重編程過(guò)程中的遷移對(duì)類iPS克隆形成非常重要。增殖特異性標(biāo)記蛋白Ki67和標(biāo)志性抗原PCNA免疫組化染色獲得了相似的結(jié)果；細(xì)胞凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后16天牛類iPS克隆，僅有1±0.4%細(xì)胞發(fā)生凋亡，而這一階段細(xì)胞增殖率為1±0.5%，因此98±0.9%細(xì)胞處于細(xì)胞沉默狀態(tài)；類iPS克隆傳代后有較高的再貼

9、壁率，但2i/LIF培養(yǎng)液不支持傳代后牛類iPS克隆的增殖。
　　 結(jié)論：本研究構(gòu)建了兩個(gè)包含不同轉(zhuǎn)錄因子順序的外源質(zhì)粒，成功的使用脂質(zhì)體和電穿孔法對(duì)牛成纖維細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并在2i/LIF培養(yǎng)液培養(yǎng)條件下成功制作biPSCs；對(duì)影響biPSCs生產(chǎn)效率的多個(gè)因素進(jìn)行探討，其中脂質(zhì)體法優(yōu)于電穿孔法、牛胚胎成纖維細(xì)胞優(yōu)于其他種類細(xì)胞、玻璃材質(zhì)培養(yǎng)容器優(yōu)于塑料材質(zhì)、飼養(yǎng)層和層粘連蛋白(LN)預(yù)處理優(yōu)于其他預(yù)處理；實(shí)驗(yàn)所得biPSCs具