人體細胞體外重編程為誘導性多能干細胞關鍵技術的研究.pdf

1、目的：本研究將攜帶胚胎特異性轉錄因子Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4基因慢病毒顆粒感染人包皮成纖維細胞(Human postnatal foreskin fibroblastshPFF),體外重編程為誘導性多能干細胞(inducedpluripotentstemcelliPSC);原代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVE)體系,將表達microRNA-302

2、-367基因慢病毒顆粒感染HUVE,探討目的基因microRNA-302-367過表達慢病毒顆粒感染HUVE體外重編程為誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cell iPSC)的關鍵技術。
　　方法：(1)以最佳病毒感染復數(shù)(multiplicity of infection,MOI值)感染hPFF,體外重編程為iPSC,通過細胞形態(tài)學、堿性磷酸酶染色進行驗證及畸胎瘤成瘤實驗對iPSC多向分化潛能進

3、行鑒定(2)采用0.1％Ⅰ型膠原酶灌注人臍靜脈,消化15min后收集人臍靜脈內(nèi)皮細胞懸液,接種于T25cm的培養(yǎng)瓶中,進行培養(yǎng)。以免疫細胞化學法進行細胞鑒定;MTS法測定細胞生長曲線。(3)將過表達綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的空病毒顆粒感染HUVE,在熒光倒置顯微鏡下觀察熒光表達情況,探討最佳感染條件及MOI值;(4)將生長狀態(tài)良好的HUVE隨機分為3組:正常對照組、含綠色熒光蛋白空病毒載

4、體感染組、目的基因感染組進行感染,第2天給予干細胞培養(yǎng)條件,在倒置顯微鏡下動態(tài)觀察細胞形態(tài)變化,探討最佳培養(yǎng)條件。
　　結果：(1)在最佳MOI值40的慢病毒感染條件下感染hPFF,感染7天后,細胞偽足收縮,形態(tài)由長梭形變?yōu)閳A形,感染25天后,可挑選細胞克隆;堿性磷酸酶染色為陽性;畸胎瘤成瘤實驗證實iPSC具有向內(nèi)、中、外三個胚層分化的潛能(2)0.1%Ⅰ型膠原酶消化人臍靜脈體外建立穩(wěn)定的HUVE系,培養(yǎng)3天后,0.25%胰蛋白酶