山羊誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的研究.pdf

1、通過向體細(xì)胞中導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子可以將體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells，iPSCs)。已經(jīng)有很多物種成功地產(chǎn)生相應(yīng)的iPSCs，但是在有蹄類家畜中，尤其是山羊，iPSCs建系成功的卻很少。本研究主要目的是通過慢病毒攜帶人源的四個(gè)多能基因:hOCT4，hSOX2，hKLF4和hcMYC導(dǎo)入山羊體細(xì)胞，通過對誘導(dǎo)體系和培養(yǎng)體系的優(yōu)化，成功將山羊體細(xì)胞重編程為iPSCs(giPSCs)，在

2、此基礎(chǔ)上，使用同樣的方法將克隆奶山羊體細(xì)胞重編程為iPSCs(tgiPSCs)，并且將tgiPSCs作為供體細(xì)胞通過核移植技術(shù)，檢測其能否在體外生產(chǎn)克隆胚胎。本文主要研究結(jié)果如下:
　　1.摸索出適合山羊iPSCs的誘導(dǎo)體系和培養(yǎng)體系
　　本試驗(yàn)在前人研究成果的基礎(chǔ)上，首先使用干細(xì)胞無血清培養(yǎng)體系“KNOCKOUT-DMEM+KSR”分別添加人源白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor，LIF)，人源

3、Beta-成纖維細(xì)胞生長因子(Beta-fibroblastgrowthfactor，β-FGF)，以及兩者都加。試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)體系中只添加LIF會導(dǎo)致giPSCs自動分化，而添加β-FGF或者兩者都加可以維持giPSCs未分化的狀態(tài)。
　　嘗試家畜ESCs和iPSCs建系經(jīng)常使用的培養(yǎng)基DMEM/F12和血清FBS，通過試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用FBS對于山羊iPSCs未分化狀態(tài)的維持要優(yōu)于KSR。用形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)選擇形態(tài)好的原代克隆進(jìn)行

4、擴(kuò)增，有的克隆重編程效果不好，傳至2～4代克隆會分化。能傳代的克隆，在5代前基本都是用機(jī)械法進(jìn)行傳代。使用酶解法進(jìn)行傳代，有的克隆比較大，酶解后可以配合機(jī)械法，將大的克隆分成小的克隆，輕輕吹打成小的細(xì)胞團(tuán)塊，否則團(tuán)塊不容易吹開，形成大的細(xì)胞團(tuán)，不利于克隆的形成。
　　2.重編程轉(zhuǎn)基因克隆奶山羊體細(xì)胞產(chǎn)生iPSCs
　　實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功獲得批量轉(zhuǎn)基因克隆奶山羊，檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因hLF已經(jīng)很好地整合到這些克隆奶山羊體細(xì)胞的基因組中

5、。在已取得成果的基礎(chǔ)上，用轉(zhuǎn)基因克隆奶山羊耳成纖維細(xì)胞作為體細(xì)胞，經(jīng)過慢病毒感染進(jìn)行重編程，成功獲得帶有hLF奶山羊iPSCs(tgiPSCs)。通過檢測發(fā)現(xiàn)，這些tgiPSCs表達(dá)干細(xì)胞多能基因OCT4，SOX2，cMYC，KLF4和NANOG;對AKP反應(yīng)呈陽性;可以在體外形成類胚體，形成的類胚體含有三胚層組織;同時(shí)可以在裸鼠的體內(nèi)形成畸胎瘤，通過HE染色發(fā)現(xiàn)，形成的畸胎瘤中也含有三胚層組織。
　　3.用tgiPSCs作為核移

6、植供體細(xì)胞更有利于核移植胚胎的發(fā)育
　　使用轉(zhuǎn)基因奶山羊皮膚成纖維細(xì)胞(tgFs)和轉(zhuǎn)基因克隆奶山羊耳成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的iPSCs(tgiPSCs)作為供體細(xì)胞，通過核移植技術(shù)生產(chǎn)克隆胚胎，分別命名為:tgF-Embryos和tgiPSCs-Embryos，同時(shí)收集了山羊體內(nèi)生產(chǎn)的胚胎，命名為:vivo-Embryos，三種胚胎都處于8-16細(xì)胞期。使用熒光定量PCR檢測了IGFs家族基因在tgF-Embryos，tgiPSCs

7、-Embryos和vivo-Embryos中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，IGF-1，IGF-1R和IGF-2R三個(gè)基因在tgF-Embryos，tgiPSCs-Embryos和vivo-Embryos三種胚胎的8-16細(xì)胞階段中的表達(dá)量沒有顯著性差異(p＞0.05），但是GF-2在tgiPSCs-Embryos中的表達(dá)量要比在tgF-Embryos中的表達(dá)量顯著要低(p＜0.01)。然而，IGF-2在tgiPSCs-Embryos和vivo-