綿羊誘導多能性干細胞的制作與鑒定研究.pdf

1、2006年，山中申彌利用病毒載體將四個轉錄因子（Oct4、Sox2、Klf4和 c-Myc）感染小鼠體細胞，獲得了類胚胎干細胞的誘導多潛能性干細胞（iPS細胞），為細胞學研究提供了新的方向，也為再生醫(yī)學領域帶來了廣闊的應用前景。動物 iPS細胞的出現對疾病模型的建立、細胞治療，種質資源的保存、改善體細胞克隆動物的生產效率等方面都有著重要的意義。
　　目的：在無飼養(yǎng)層條件下建立電穿孔轉染五因子制備綿羊 iPS細胞，掌握 iPS細胞誘

2、導這一技術，為進一步研究細胞重編程機制及未來 iPS細胞的臨床應用奠定基礎。
　　方法：1本實驗采用組織培養(yǎng)法，雙酶法分離出中國美利奴成纖維細胞，并進行傳代培養(yǎng)。2將含有人的 Oct4；Sox2、Klf4；l-Myc、lin28基因的3個質粒，分別采用4-D電轉染儀中 EH-100，EN-150，CZ-167，CA-137四個電轉程序轉染到綿羊成纖維細胞中，篩選出最適合綿羊成纖維細胞的電轉染程序；細胞密度和質粒濃度均相同，質粒濃度

3、不同對 AP染色陽性（AP+）克隆的影響；細胞密度，質粒濃度均一致，質粒比例不同，對 AP+克隆的影響；細胞密度，質粒濃度，質粒濃度均一致，培養(yǎng)液中有無添加Vc，對 AP+克隆的影響，以選出最適合制備 iPS的方案。3通過外形觀察、定量 PCR、免疫熒光染色、轉錄組分析等來檢測所制備的綿羊類 iPS細胞。
　　結果與結論：（1）雙酶法快速成功分離出中國美利奴綿羊耳源成纖維細胞，為重編程的提供優(yōu)良的體細胞。（2）采用 EH-100電

4、轉程序，細胞密度為5×106個/mL，質粒比例1:1:1，質粒質量濃度為0.1 mg/L，培養(yǎng)液中添加0.05 mg/L Vc條件下，AP染色陽性（AP+）克隆形成率達14％，優(yōu)化的電轉染的方法和培養(yǎng)方案有效提升了綿羊類誘導性多潛能干細胞的制備效率。（3）在無飼養(yǎng)層條件下，通過電轉染法將五因子導入綿羊耳源成纖維細胞，并成功重編程為類 iPS細胞，在外觀形態(tài)、多能基因的表達、轉錄組等方面的鑒定結果都表明其具有多潛能性，為以后進一步研究綿羊