可吸收生物材料復合他克莫司及NETRIN-1因子制備軸突導向神經鞘管的實驗研究.pdf

1、周圍神經損傷是臨床上常見的疾病，常由過度牽拉、切割、壓迫、火器、電燒傷及放射性燒傷和醫(yī)源性損傷造成。損傷后如無法給予及時有效的修復，神經突觸纖維化將造成神經和肌肉的永久性功能性障礙，對日后的康復及生活造成不良的影響。
　　周圍神經由于其特殊的結構和復雜的細胞生理，受到損傷后難以快速有效的自我恢復，臨床上即使經過一段時間治療后，仍存在一定程度的神經功能缺失、神經痛等難以解決的問題，所以周圍神經損傷后的修復一直是基礎和臨床科研的重點和

2、熱點。
　　現階段臨床上對于神經損傷的治療多采用神經直接縫合或自體神經移植、藥物保護及促進軸突再生的方法進行治療，臨床結果差強人意。對神經損傷的動物模型進行組織學觀察發(fā)現，導致周圍神經縫合后療效不佳的原因主要有以下幾個方面:(1)神經吻合后斷端扭曲;(2)吻合口瘢痕組織的侵入;(3)神經的無效再生（即近端的運動神經纖維長入遠端的感覺神經纖維鞘內，或近端的感覺神經纖維長入遠端的運動神經纖維鞘內）;(4)神經再生速度遲緩，神經肌肉突觸

3、纖維化等原因?，F階段無論是采用外膜縫合或者是束膜縫合方法均無法完全避免上述問題。如何使損傷后的周圍神經組織及時有效的恢復最佳功能，仍是目前困擾醫(yī)學工作者的一大難題。
　　組織工程技術（Tissue Engineering）作為一種跨越生命科學和工程科學的交叉學科，近些年來取得了長足的發(fā)展和應用。其基本理論是構建一種仿生物的組織工程框架，可以為細胞的生長提供支撐，隨著組織和器官的逐步恢復，支架本身的材料可以通過自身的降解被自身的組織

4、所代替，其降解的產物可以通過代謝途徑轉化成對人體無害的分子排出體外。并且，隨著人們對這項技術認識的逐步加深，通過在支架上輔以特殊的有針對性的細胞因子，可以有效的加快損傷組織的再生與恢復。同時人們對于利用這項技術修復周圍神經損傷提出了許多先進的觀點。理想的神經修復鞘管應具有以下的結構和組成:a支架材料要有仿生物學設計，可以提供良好的力學性能和可塑性，同時，管壁應表現為半透膜性質，以保證營養(yǎng)物質的交換和組織再生代謝產物的排出，同時可以阻止纖

5、維瘢痕的長入;b加入神經營養(yǎng)因子，并能有效控制其釋放;c鞘管降解的時間應能充分滿足神經生長所需要的時間，否則未等神經完全恢復，鞘管已經降解，起不到相應的保護作用。
　　本研究首次嘗試通過靜電紡絲技術構建了以聚乳酸-羥基乙酸共聚物/殼聚糖為主體的復合了他克莫司(Tacrolimus，FK506)以及Netrin-1因子的軸突導向神經鞘管。為了達到上述要求，本試驗進行了下述方面的研究:(1)利用微流控技術構建高通量藥物篩選芯片，明確局

6、部使用FK506以及Netrin-1神經軸突導向因子的最佳濃度。(2)殼聚糖復合FK506及Netrin-1神經鞘管的制備與性能修飾。(3)檢測神經鞘管的理化性質以及生物安全性。
　　實驗一使用微流控芯片篩選局部應用FK506及Netrin-1的最佳有效濃度的研究目的:設計并制作微流控芯片，篩選局部應用FK506及Netrin-1的最佳有效濃度。方法:基于雷諾效應原理，設計出包含濃度梯度生成器以及細胞培養(yǎng)室的微流控芯片，利用熒光成

7、像驗證芯片在細胞水平篩查藥物對神經再生作用的能力。分離培養(yǎng)、擴增大鼠的雪旺細胞以及背根神經元細胞，將細胞接種于芯片后，使用CCK-8試劑盒檢測雪旺細胞增殖水平，同時測量背根神經節(jié)細胞軸突生長長度。通過液相質譜色譜分析藥物的有效濃度。并于96孔板中重復不同濃度下的細胞增殖實驗，檢測微流控芯片結果的可靠性。
　　結果:成功構建了微流控芯片，通過熒光強度驗證了芯片生成濃度梯度的可靠性。利用芯片獲得FK506局部最佳濃度為1.786±0.

8、014ng/ml; Netrin-1最佳局部濃度為51.42±0.14 ng/ml。
　　結論:1.制作的微流控芯片可以有效形成藥物的作用濃度梯度;2.篩選出FK506神經細胞培養(yǎng)最佳濃度為1.786±0.014ng/ml; Netrin-1最佳濃度為51.42±0.14 ng/ml。
　　實驗二靜電紡絲技術構建聚乳酸-羥基乙酸共聚物/殼聚糖復合他克莫司及Netrin-1軸突導向神經鞘管的研究目的:1.構建單電場雙噴頭靜電紡

9、絲設備。2.制備FK506及Netrin-1軸突導向神經鞘管。3.對鞘管的結構以及基本理化性質進行評估。
　　方法:按照實驗要求搭建靜電紡絲設備，并對設備進行改造，使其可以滿足雙噴頭共紡的需求。使用單電場雙噴頭技術，對聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid)，PLGA)和殼聚糖/FK506/Netrin-1共混溶液進行共紡，并不斷調整各參數配比，獲得復合的神經鞘管。對鞘管進行掃描電鏡觀察，力

10、學機檢測鞘管的彈性模量，并對鞘管的基本理化性質做出測定。
　　結果:構建并改良了靜電紡絲設備。獲得了滿足局部最佳濃度的FK506及Netrin-1因子的電紡溶液配比，并制備了軸突導向神經鞘管。神經鞘管具有納米纖維結構，復合鞘管的PLGA纖維平均直徑為197±9.9nm，殼聚糖纖維為105±4.3nm，孔隙率為76.25％，吸水率為11.2％，干燥狀態(tài)下彈性模量為1.525±0.116，濕潤狀態(tài)下彈性模量為0.819±0.125。鞘

11、管體外降解10周后，質量降解為0.138g，降解率47.26％。FK506以及Netrin-1因子可以在45日內提供最佳有效濃度。
　　結論:構建的單電場雙噴頭靜電紡絲設備符合實驗要求。獲得了FK506及Netrin-1因子的電紡溶液配比，制備了PLGA/殼聚糖復合FK506及Netrin-1軸突導向神經鞘管。鞘管具有納米級纖維，良好的親水性和理化特點。
　　實驗三 PLGA/殼聚糖復合FK506及Netrin-1軸突導向神

12、經鞘管生物安全性的研究目的:對PLGA/殼聚糖復合FK506及Netrin-1軸突導向神經鞘管生物安全性進行檢測和評價。
　　方法:通過大鼠體內注射浸提液、皮下刺激實驗、P(II)測定、溶血試驗、細胞增殖實驗以及AO-PI染色評價鞘管的體外生物安全性。同時，將PKH26染色的大鼠BMSC/鞘管復合物植入裸鼠體內，利用活體熒光成像系統(tǒng)檢測支架在體內降解過程中的生物安全型，并對植入SD大鼠體內的鞘管進行HE染色，評價鞘管周圍纖維囊厚度

13、、炎性細胞數量和8周內質量損失。
　　結果:各組實驗動物無死亡，全身急性毒性反應陰性，P(II)為0;溶血率為0.058％，無溶血作用;細胞增殖實驗、AO-PI染色、體內植入鞘管及其降解產物均未表現出細胞毒性。鞘管纖維囊厚度以及周圍炎癥細胞數量隨時間降低，且降解周期內炎性細胞及纖維細胞無法透過管壁侵入管腔。
　　結論:采用PLGA/殼聚糖復合FK506及Netrin-1制備的神經修復鞘管以及其降解產物具有良好的生物安全性和組