他克莫司生物合成的途徑特異性調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、他克莫司(FK506)是鏈霉菌生產(chǎn)的一種23元大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，在臨床上用于治療肝臟、腎臟、胰腺和心臟等器官移植后排斥反應(yīng)。我們以他克莫司工業(yè)生產(chǎn)菌株——筑波鏈霉菌L19為研究對(duì)象，其生物合成基因簇中包含兩個(gè)調(diào)控基因fkbN和tcs7。
　　首先，我們利用逆轉(zhuǎn)錄PCR對(duì)他克莫司合成基因簇進(jìn)行轉(zhuǎn)錄單元分析，確定了其中含有8個(gè)轅錄單元:tcsA-tcsB-tcsC-tcsD; tcs1; tcs2-tcs3-tcs4-tcs5;f

2、kbG;fkB-fkb C-fkb L-fkb K-fkbJ-fkb I-fkbH;fkbO-fkbP-fkb A-fkb D-fkb M; tcs6-fkb Q-fkbN;tcs7。在筑波鏈霉菌L19中過表達(dá)以bN和tcs7將他克莫司的產(chǎn)量分別提高了76％和40％，表明FkbN和Tcs7均是他克莫司合成基因簇內(nèi)的正調(diào)控因子。
　　熒光定量PCR比較野生株L19和fkbN過表達(dá)菌株L21的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)，包括調(diào)控基因tcs7在內(nèi)的目

3、的基因轉(zhuǎn)錄水平都得到顯著增強(qiáng)。FkbN屬于LAL家族，比對(duì)顯示FkbN可能具有ATPase活性并受到ATP的調(diào)節(jié)。異源表達(dá)純化FkbN-DBD進(jìn)行EMSA反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)FkbN-DBD結(jié)合在四個(gè)啟動(dòng)子區(qū):tcsAp、fkbGp、fkbB-fkbO間隔區(qū)、tcs6-tcs7間隔區(qū)。DNaseⅠ footprinting確認(rèn)了與FkbN-DBD結(jié)合的啟動(dòng)子序列具有特異性，為10 bp左右的反向互補(bǔ)保守序列。這四個(gè)啟動(dòng)子區(qū)控制著他克莫司生物合成中

4、PKS/NRPS基因、特殊前體合成基因、調(diào)控基因tcs7等的轉(zhuǎn)錄，表明FkbN通過激活這些基因的轉(zhuǎn)錄提高了他克莫司的產(chǎn)量。另一個(gè)調(diào)控因子Tcs7是LysR家族調(diào)控蛋白，我們生物信息學(xué)比對(duì)分析了包括Tcs7在內(nèi)的10種LysR蛋白，發(fā)現(xiàn)這些蛋白具有35.3％序列相似性，結(jié)合LysR家族蛋白的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，我們推測Tcs7可能具有自調(diào)控功能。熒光定量PCR比較野生株L19和tcs7過表達(dá)菌株L22的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)包括fkbN在內(nèi)的目

5、的基因表達(dá)量均有上調(diào)。將Tcs7的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行異源表達(dá)純化，EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Tcs7-DBD只能結(jié)合在tcs6-tcs7間隔區(qū)，該間隔區(qū)存在兩個(gè)啟動(dòng)子分別控制tcs7和tcs6-fkbQ-fkbN的轉(zhuǎn)錄，表明Tcs7可能直接正調(diào)控fkbN從而提高他克莫司產(chǎn)量。
　　基于以上結(jié)果，我們對(duì)他克莫司的途徑特異性調(diào)控通路進(jìn)行重組，構(gòu)建了fkbN和tcs7的雙過表達(dá)菌株L23，將他克莫司的產(chǎn)量提高了89.3％。
　　綜上所