他克莫司對脊髓運動神經(jīng)元保護作用及相關機制的研究.pdf

1、急性脊髓損傷(Acute Spinal Cord Injury，ASCI)是一類非常嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，常導致?lián)p傷平面之下的運動和感覺功能全部或部分喪失。脊髓損傷患者一生需要的治療費用非常昂貴，治療效果又不理想，所以給個人和家庭都帶來了巨大的經(jīng)濟和心理負擔。因此，怎樣提高治療急性脊髓損傷的效果，恢復或者減少其所造成的神經(jīng)功能損害，讓患者重新回歸到正常的社會生活工作中來，具有非常重要的意義。
　　他克莫司(Tacrolimus，F(xiàn)K

2、506)商品名普樂可復，已經(jīng)通過美國FDA驗證，1984年由日本藤澤制藥公司在筑波泥土的鏈霉菌里提取出來的發(fā)酵產(chǎn)物，其屬于大環(huán)內酯類抗生素，臨床上具有很強的免疫抑制作用。據(jù)文獻報道，F(xiàn)K506的受體蛋白FKBP(FK506 Binding Protein)不但存在于免疫系統(tǒng)中，并且在神經(jīng)系統(tǒng)內的也極為豐富，并是前者的10～50倍。但是，他克莫司作為免疫抑制類藥物雖然具有神經(jīng)營養(yǎng)和保護的作用，同時也具有神經(jīng)毒性作用，研究表明其神經(jīng)毒性作用

3、與藥物的濃度有關，所以如何在發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護作用的同時避免產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用是一個難點。目前關于FK506的神經(jīng)營養(yǎng)與神經(jīng)保護的作用機制尚不清楚，同時也沒有關于他克莫司對脊髓運動神經(jīng)元缺血缺氧損傷保護作用方面的研究。實驗中我們通過成功建立新生大鼠脊髓運動神經(jīng)元的培養(yǎng)體系，進而篩選適宜運動神經(jīng)元生長的最佳他克莫司藥物濃度。在獲得最佳藥物濃度后構建脊髓運動神經(jīng)元缺血缺氧模型，設立對照組和藥物組，觀察并研究他克莫司的神經(jīng)營養(yǎng)及保護作用并闡

4、述其相關的機制。本研究填補了目前沒有關于他克莫司對于脊髓運動神經(jīng)元缺血缺氧保護作用研究的空白，同時也為他克莫司的神經(jīng)營養(yǎng)作用提供進一步的研究支持，為臨床上利用他克莫司治療急性脊髓損傷疾病給予了新的理論依據(jù)。
　　本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 新生大鼠脊髓運動神經(jīng)元細胞的純化培養(yǎng)與鑒定
　　目的:探討新生大鼠脊髓運動神經(jīng)元的分離、純化和培養(yǎng)方法，并予以分類鑒定，測定脊髓運動神經(jīng)元純度及存活率，建立新生大

5、鼠脊髓運動神經(jīng)元的純化培養(yǎng)體系。
　　方法:取新生大鼠的脊髓腹側組織分離消化成細胞懸液，經(jīng)密度梯度離心及差速貼壁后純化培養(yǎng)，5d后運用免疫細胞化學雙標染色法對培養(yǎng)蓋片上的細胞進行分類和鑒定，計數(shù)隨機50個視野中各細胞成分的平均含量。初接種后隨機選取50個視野進行細胞計數(shù)，以0d的細胞數(shù)目均值作為基數(shù)100％。繼續(xù)在培養(yǎng)后的1、3、5d各時間點用上法進行細胞計數(shù)，并進行存活率計算及統(tǒng)計學分析。
　　結果:細胞的生長狀況良好，神

6、經(jīng)元細胞占細胞總數(shù)的85.8％。其中，運動神經(jīng)元細胞占總數(shù)的71.6％，星形膠質細胞占總數(shù)的7.8％，非神經(jīng)元細胞占總數(shù)的6.4％。神經(jīng)元細胞的存活數(shù)目較多，5d后神經(jīng)元細胞的存活率仍保持在57.8％左右。
　　結論:取新生大鼠的腹側脊髓組織并結合密度梯度離心法和差速貼壁接種法可以培養(yǎng)出高純度的脊髓運動神經(jīng)元，同時脊髓運動神經(jīng)元的高存活率也保證了應用運動神經(jīng)元細胞進行相關實驗的順利進行。
　　第二部分 他克莫司對脊髓運動神經(jīng)

7、元保護作用及相關機制的實驗研究
　　目的:尋找他克莫司(FK506)促進脊髓運動神經(jīng)元生長的最佳濃度，觀察其對缺血缺氧的脊髓運動神經(jīng)元有無保護作用，并探討其可能的相關機制。
　　方法:取已培養(yǎng)3d的脊髓運動神經(jīng)元細胞分別加入不同濃度的他克莫司，分為:空白對照組（A組）、100pmol/L FK506組（B組）、1nmol/LFK506組（C組）和10nmol/L FK506組（D組），繼續(xù)培養(yǎng)2d，通過細胞免疫化學法觀察神經(jīng)

8、元細胞的生長情況，四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法）檢測神經(jīng)元細胞的活力，逆轉錄聚合酶鏈式反應法（RT-PCR法）檢測生長相關蛋白—43信使核糖核酸(GAP-43mRNA)的表達情況。在獲得了FK506的最佳濃度后，另取一部分脊髓運動神經(jīng)元分為對照組，缺血缺氧組，F(xiàn)K506治療組，將已培養(yǎng)3d的缺血缺氧組和FK506治療組的運動神經(jīng)元細胞培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，同時用石蠟油封閉各孔造成缺氧條件。缺血缺氧組在損傷的前一天每孔給予0.01mo

9、l/L pH7.2的PBS800μl，F(xiàn)K506治療組在損傷前一天每孔加入已得到的最佳濃度FK506800μl，繼續(xù)培養(yǎng)2d，對照組不做任何處理。通過免疫熒光法觀察各組神經(jīng)元細胞生長情況，MTT法檢測各組神經(jīng)元細胞活力，RT-PCR法檢測各組神經(jīng)元細胞GAP-43mRNA的表達，Western-blot法檢測在加入FK506后各時間點ERK、p-ERK、GAP43等蛋白的表達變化。
　　結果:1nmol/L FK506組（C組）的

10、新生大鼠脊髓運動神經(jīng)元數(shù)量和突起長度明顯優(yōu)于A組、B組和D組。同時C組的MTT吸光度OD值及GAP-43mRNA的相對表達量也明顯高于A組、B組和D組，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。缺氧缺血造模后的免疫熒光結果顯示，F(xiàn)K506治療組的神經(jīng)元數(shù)量和突起長度均明顯優(yōu)于缺血缺氧組，F(xiàn)K506治療組的MTT吸光度OD值及GAP-43mRNA的表達量也均明顯高于缺血缺氧組，具有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。Western-blot結果顯

11、示，在加入FK506作用不同時間點后，F(xiàn)K506治療組運動神經(jīng)元p-ERK的表達量較缺血缺氧組均有顯著增加，并在4小時后達到頂峰，而GAP-43的表達在8小時后達到頂峰。
　　結論:對新生大鼠脊髓運動神經(jīng)元生長促進和保護作用的FK506最佳濃度是1nmol/L。FK506可提高體外缺血缺氧損傷的新生大鼠脊髓運動神經(jīng)元的細胞活性，并增加p-ERK和GAP-43在脊髓運動神經(jīng)元中的表達。其中p-ERK開始表達的時間和達峰時間均早于的G

12、AP-43，支持GAP-43為p-ERK下游表達分子的觀點，提示缺氧缺血后ERK的活化可增加GAP-43的表達，而后者則具有促神經(jīng)再生和神經(jīng)修復的作用。
　　第三部分 他克莫司治療大鼠急性脊髓損傷的實驗研究
　　目的:觀察他克莫司(FK506)對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能的改善作用并探討可能的相關機制。
　　方法:隨機將72只健康SD大鼠分成三組:假手術組、損傷模型組、FK506治療組，其中損傷模型組和FK506治療組采用

13、Allen's法擊傷大鼠T10脊髓制造大鼠急性脊髓損傷模型，假手術組僅做椎板切除術。其中FK506治療組于術后10分鐘給予0.3mg/kg的FK506腹腔注射，之后每天注射1次，連續(xù)2周，其余兩組均給予等體積的生理鹽水。造模后每組根據(jù)取材時間進一步分為術后1、2、4、6h四小組，每小組6只，測定脊髓損傷處組織MDA、SOD、NO含量。造模后1、3、7、14、21d采用甲苯胺藍染色觀察脊髓組織病理學改變，并進行脊髓功能BBB評分及斜板實驗

14、評價大鼠神經(jīng)功能恢復情況。
　　結果:傷后1、3、7、14、21d FK506治療組脊髓損傷區(qū)出血及壞死情況均較損傷模型組輕，而斜板實驗和BBB評分均明顯優(yōu)于損傷模型組，兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，損傷模型組與FK506治療組MDA、SOD及NO含量在損傷后1h未見明顯差異，而在損傷后2h、4h和6h顯示FK506治療組對急性脊髓損傷后MDA及NO含量的升高具有明顯的抑制作用，對SOD含量的降低有明顯的提升作用，具