編碼FLC-FLAG和SVP-HA標簽蛋白表達載體轉化芥菜的研究.pdf

1、植物開花的正常調控是其正常繁衍后代、進行物種演化的保障，對農作物來說，開花過程與其產量和品質有緊密的關系，對于需要收獲營養(yǎng)器官的農作物，通過延遲開花時間，延長營養(yǎng)生長周期，得到更高的農作物產量有著重要的意義。
　　 芥菜（Brassicajuncea）是十字花科的重要作物，在我國擁有廣泛的種植面積，抽薹開花是芥菜重要的生物學特性。在生產實踐中，“先期抽薹”問題嚴重地影響了芥菜的產量和品質，是芥菜類蔬菜春季生產的主要問題。通過延遲

2、開花時間，培育晚抽薹品種是解決這一問題的根本途徑。
　　 植物開花是植物從營養(yǎng)生長轉變?yōu)樯成L的生理發(fā)育過程，開花調控受環(huán)境的影響，同時也受基因調控。分子生物學研究表明，調控植物開花的基因分為4類:開花時機基因、花分生組織特性基因、花器官特性基因及生物鐘相關基因。這些基因組成了復雜的調控網絡，并通過4種途徑調控植物開花，包括響應外界光信號的光周期途徑、對低溫有應答的春化途徑、響應內源激素的赤霉素途徑和感受自身發(fā)育狀況的自主途徑

3、。在模式植物擬南芥中，F(xiàn)LC(FloweringLocusC)和SVP（ShortVegetativePhase）都是開花核心調節(jié)因子，它們的超量表達對開花具有抑制作用。
　　 本試驗在芥菜FLC與SVP體外蛋白互作已有基礎之上，將開花抑制基因FLC和SVP同標簽蛋白(FLAG，HA)重組后，轉入芥菜中，其中標簽蛋白用于純化重組蛋白，為FLC和SVP體內相互作用的深入研究奠定基礎，對芥菜花期調控及解決“先期抽薹”等難題，具有重要

4、意義。
　　 本試驗以根芥（BrassicajunceaCoss.）為材料，選取下胚軸作為外植體，建立芥菜高頻再生體系，以農桿菌介導侵染，經潮霉素抗性篩選后，將抗性芽生根培養(yǎng)和PCR檢測，并煉苗移栽，獲得轉基因植株和種子。研究結果如下:
　　 芥菜苗下胚軸在不同濃度NAA和6-BA培養(yǎng)基中，以MS+NAA0.1mg/L+6-BA1mg/L配比獲得的分化率最高，為83.33％;在MS+NAA0.1+6-BA1mg/L培養(yǎng)基

5、上，以不同苗齡(4-8d)進行愈傷組織誘導及芽的分化試驗，發(fā)現(xiàn)5d苗齡的下胚軸分化率最高，為42.11％;在不同生根培養(yǎng)基中進行下胚軸生根實驗，以培養(yǎng)基1/2MS（3％蔗糖，0.8％瓊脂）+NAA0.1mg/L生根最好，根多且粗壯，根系發(fā)達;當潮霉素濃度為4mg/L時，已完全抑制未經轉化的下胚軸分化再生，而在2mg/L時有2.22％的分化率，即潮霉素篩選壓力為4mg/L;在不同羧芐青霉素濃度中(200mg/L，300mg/L，400mg

6、/L，500mg/L)，濃度為300mg/L時，下胚軸分化率最高，為45.46％。在農桿菌轉化過程中，以0-4d進行外植體預培養(yǎng)時間的研究，當預培養(yǎng)2d時，下胚軸分化率最高，為23.33％，隨著時間的增加，分化率下降;農桿菌侵染10min時，下胚軸分化率最高，侵染時間達20min時，切口出現(xiàn)嚴重褐化;在不同農桿菌濃度中(OD600:0.1，0.3，0.5，0.7)，OD600為0.5時獲得了較高的分化率;在共培養(yǎng)試驗中，統(tǒng)計培養(yǎng)0-4d

7、的分化出芽率，其中在共培養(yǎng)3d時，下胚軸分化率最高，為5.56％。
　　 以試驗建立的高頻再生體系進行芥菜的遺傳轉化，將開花抑制基因FLC和SVP同標簽蛋白(FLAG、HA)重組(FLC-FLAG、SVP-HA)，之后與表達質粒pCAMBIA1302構建正確的35S::FLC-FLAG和35S::SVP-HA，分別記為pCA1302FG、pCA1302SH。分別將這兩種重組質粒導入農桿菌中，進行PCR檢測。電泳結果證明pCA13