K域的亞域介導芥菜開花負調因子SVP與FLC同源和異源蛋白互作.pdf

1、開花是植物從營養(yǎng)生長時期向生殖生長的轉換，是植物生命周期中的一個重要發(fā)育階段，它決定了植物能否完成有性繁殖。開花時間的早晚，決定了果實，種子等主要植物產品產量上市時間。因此植物開花的研究對于生產和育種具有重大的經濟價值。芥菜作為一種十分重要的十字花科類蔬菜作物，在我國各地都有著一定的種植面積。開花時間除了受光照（如日照強度，長度）、溫度等外在環(huán)境的影響，還受植物生長狀態(tài)、發(fā)育階段、遺傳因素等內在條件影響。主要有自主途徑、春化途徑、光周期

2、途徑和赤霉素途徑四條途徑調控芥菜開花。雖然這四條途徑都有著各自的下游基因調控網絡，但最終都會匯集到開花整合子，完成開花調控。目前已經發(fā)現了一些的與植物開花相關的基因，如FLOWERINGLOCUS T(FT), SUPPRESSOR OF CO OVEREXPRESSION1(SOC1),FLOWERINGLOCUS C(FLC)，SHORT VEGETATIVE PHASE(SVP)等，其中FT與SOC1促進開花、FLC與SVP抑制開

3、花。
　　SVP基因最早在擬南芥中發(fā)現，它是從早花型突變體中通過En-1轉座子第一個被確認，位于第2條染色體上，具有抑制開花的作用。SVP蛋白屬典型的MIKC型蛋白，含有一個保守性較強的MADS域和K域，以及保守性稍弱的I域和C域。本實驗室前期研究發(fā)現芥菜SVP基因編碼的蛋白也為MIKC型MADS域蛋白。FLC是一個關鍵的開花抑制基因，屬于MADS-box基因，其編碼的的蛋白質屬于MADS-box轉錄因子。本實驗室前期研究證明，芥

4、菜FLC與SVP蛋白相互作用，形成一個二聚復合物，對環(huán)境信號進行共同介導，抑制下游開花整合子FT與SOC1的表達，進而抑制植物開花。同時發(fā)現，FLC與SVP互作域為K域，但是K域可以分為K1，K2，K3三個亞域究竟是哪個亞域對蛋白互作起決定性作用，目前仍不清楚。故本研究對芥菜FLC與SVP的互作亞域進行了篩選。
　　1、芥菜FLC與SVP亞域的克隆及酵母載體的構建
　　本研究以實驗室保存的芥菜酵母重組質粒pGADT7-FLC

5、、pGADT7-SVP、pGBKT7-FLC、pGBKT7-SVP序列為參照，設計引物。分別亞克隆了芥菜SVP的全長與7個截短體:BjSVP(MIKC)編碼241個氨基酸、BjSVP△1(I)編碼57個氨基酸、BjSVP△2(K)編碼78個氨基酸、BjSVP△3(IK)編碼111個氨基酸、BjSVP△4(IK1L1K2L2編碼86個氨基酸、BjSVP△5(IK1L1K2)編碼80個氨基酸、BjSVP△6(IK1L1)編碼64個氨基酸、B

6、jSVP△7(IK1)編碼52個氨基酸;以及FLC全長與5個截短體:BjFLC(MIKC)編碼197個氨基酸、BjFLC△1(I)編碼57個氨基酸、BjFLC△2(K)編碼54個氨基酸、BjFLC△3(IK)編碼115個氨基酸、BjFLC△4(IK1K2)編碼108個氨基酸、BjFLC△5(IK1)編碼78個氨基酸。同時構建各個片段的酵母雙雜交重組表達載體，分析由K域亞域介導的FLC與SVP異源、同源蛋白相互作用的亞域。
　　利用

7、同源重組技術，構建了FLC與SVP各個截短體的酵母表達載體pGBKT7-BjFLC、pGBKT7-BjFLC△1～5、pGBKT7-BjSVP以及pGADT7-BjSVP、pGADT7-BjSVP△1～7、pGADT7-BjFLC。利用醋酸鋰轉化法將重組酵母質粒轉化到感受態(tài)酵母中，得到酵母轉化子Y2Hgold[pGBKT7-BjFLC]、Y2Hgold[pGBKT7-BjSVP]、Y2Hgold[pGBKT7 BjFLC△1～5]和Y1

8、87[pGADT7 BjSVP]、Y187[pGADT7BjFLC]、Y187[pGADT7 BjSVP△1～7]。在毒性檢測中，轉入pGBKT7重組載體的轉化子經SD/-Trp篩選發(fā)現各重組質粒對Y2Hgold菌株無毒性，轉入pGADT7重組載體的轉化子經SD/-Leu篩選發(fā)現各重組質粒對Y187菌株無毒性。在自激活檢測中，轉入pGBKT7重組載體的轉化子經SD/-Trp、SD/-Trp/X-a-Gal、SD/-Leu/-Trp(DD

9、O)、SD/-Trp/X-a-Gal/AbA培養(yǎng)基的逐層篩選發(fā)現各轉化子在Y2Hgold菌株中不存在自激活現象;轉入pGADT7重組載體的轉化子經SD/-Leu、SD/-Leu/X-a-Gal、SD/-Leu/-Trp(DDO)、SD/-Leu/X-a-Gal/AbA培養(yǎng)基的逐層篩選發(fā)現各轉化子在Y187菌株中不存在自激活現象。
　　2、K域亞域介導的FLC與SVP異源蛋白相互作用
　　Y187[pGADT7-Bj SVP△

10、1～7]分別與Y2Hgold[pGBKT7-BjSVP]轉化菌落兩兩組合，融合酵母中Y187[pGADT7-BjSVP△2～7]×Y2HGold[pGBKT7-BjFLC]、Y187[pGADT7-BjSVP]×Y2HGold[pGBKT7-BjFLC]在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/AbA（QDO/X-α-Gal/AbA）平板上可以長出藍色菌落。由此推測在FLC與SVP的異源蛋白相互作用中，BjSVP蛋

11、白K域的K1亞域是該相互作用的結合域。β-半乳糖苷酶活性檢測和方差分析表明:在異源蛋白相互作用過程中，BjSVP K蛋白中的K2亞域可以加強蛋白的相互作用，K3亞域和L1連接區(qū)對蛋白互作強度沒有影響，L2連接區(qū)對蛋白的相互作用具有削弱作用。
　　Y2HGold[pGBKT7-BjFLC△1～5]分別與Y187[pGADT7-BjSVP△7]兩兩融合，融合菌Y2HGold[pGBKT7-BjFLC]×Y187[pGADT7-BjSV

12、P△7]、Y2HGold[pGBKT7-BjFLC△2～5]×Y187[pGADT7-BjSVP△7]可以在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/AbA(QDO/X-α-Gal/AbA)平板上長出藍色菌落。由此推測在BjFLC蛋白中K域的K1亞域是該相互作用的結合域。β-半乳糖苷酶活性檢測和方差分析表明:在異源蛋白相互作用過程中FLC蛋白K域中的K2亞域可增加作用強度，而K3亞域可減弱蛋白作用強度。
　　3

13、、K域亞域介導的SVP與FLC同源蛋白相互作用
　　在SVP與SVP同源蛋白互作域篩選實驗中，轉化子Y187[pGADT7-BjSVP△1～7]與轉化子Y2Hgold[pGBKT7-BjSVP]分別兩兩融合，融合菌V187[pGADT7-BjSVP△2]×Y2HGold[pGBKT7-BjSVP]、Y187[pGADT7-Bj SVP△3]×Y2HGold[pGBKT7-BjSVP]可以在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-Hi

14、s/X-α-Gal/AbA(QDO/X-α-Gal/AbA)平板上長出藍色菌落。因此推測SVP同源蛋白相互作用中完整的K域(K1L1K2L2K3)是BjSVP自身互作所必須的，K域亞域的缺失會破壞自身蛋白的互作。
　　在FLC與FLC同源蛋白互作域篩選試驗中，轉化子Y2Hgold[pGBKT7-BjFLC△1～5]與轉化子Y187[pGADT7-FLC]兩兩融合，融合菌Y2Hgold[pGBKT7-FLC△2～5]×Y187[pG