芥菜AGL6、AGL15與SOC1、AGL24、SVP蛋白的互作研究.pdf

1、開花是植物生命活動過程中一個重要而復雜的過程，植物能感應環(huán)境因子的改變，并結合自身遺傳因子做出相應的發(fā)育調控，以便在合適的環(huán)境條件下做出花的發(fā)育，從而最大可能的獲取生存和繁殖后代的機會。這就使植物利用環(huán)境及遺傳因子調控植物營養(yǎng)生長到生殖生長（即開花）的轉變顯得尤為重要，晚開花可能讓植物生長得更加強壯，但不利于種子的產生；相對的，早開花不能保證植物有足夠的能量儲備來繁衍后代，由此可知開花時間的早晚關系到植物種子的形成，從而影響到植物種族的

2、延續(xù)。影響植物開花的因素很多，包含環(huán)境因子和遺傳因子，植物能通過多種遺傳途徑來對外界環(huán)境和植物內環(huán)境做出相應的反應，這些遺傳途徑復雜而精確地調控植物開花。遺傳途徑中涉及到多種調控花發(fā)育的基因整合子，包括促進開花的基因LEAFY、FT、SOC1、CO以及開花抑制基因FLC、SVP、FLM等。這些基因編碼的蛋白大都屬于于MADS-Like蛋白，如SCO1、AGL24、SVP等，它們能直接或間接的調控開花。有關SOC1、AGL24、SVP等蛋

3、白的作用機制目前被廣泛研究，其調控機制以及蛋白間的相互作用已經比較清楚。芥菜(Brassica juncea Coss)中開花整子SOC1、AGL24、SVP、FLC等的研究也有相應報道，但是有關芥菜AGL6、AGL15與SOC1、AGL24、SVP之間的互作關系未見報道。為探究芥菜AGL6、AGL15在芥菜開花網絡中的調控關系，我們以芥菜QJ為材料，克隆芥菜AGL6、AGL15基因，并用酵母雙雜交技術和雙分子熒光互補技術研究芥菜AGL

4、6、AGL15蛋白與其他開花整合子蛋白間的關系；在此基礎上進一步使用酵母單雜交和雙螢光素酶技術研究了AGL15啟動子與其他蛋白之間的作用關系。
　　主要試驗結果如下：
　　1.芥菜AGL6、AGL15的克隆及生物信息學分析
　　以芥菜莖尖總RNA反轉錄cDNA第一鏈為模板，分別擴增得到芥菜AGL6基因和AGL15基因的cDNA序列：AGL6的cDNA序列為759bp，編碼252個氨基酸；AGL15的cDNA序列為795

5、bp，編碼264個氨基酸。以芥菜基因組DNA為模板擴增得到AGL6和AGL15的NDA序列為分別為1771bp和1616bp，cDNA和DNA對比發(fā)現，AGL15和AGL6都含8個外顯子和7個內含子。二者均屬MIKC型蛋白，預測表明AGL6和AGL15蛋白大小為分別為28.85kDa和30.13kDa，理論等電點分別為9.15和9.02，兩者都屬于不穩(wěn)定蛋白，均與歐洲油菜親緣關系最近。二級結構預測表明AGL6和AGL15分別含有α螺旋約

6、40％與47%，主要集中在K域。
　　2．芥菜AGL15啟動子克隆與分析
　　使用芥菜基因組DNA為模板，利用染色體步移法克隆得到AGL15的啟動子890bp，分析表明AGL15啟動子與油菜親緣關系最近。對其進行生物信息學分析發(fā)現該序列中含有TATA-box、CGTCA-motif、TGGTTT-ARE等多種啟動子相應元件。
　　3.芥菜AGL6與SOC1、AGL24、SVP蛋白互作鑒定
　　將克隆得到的AGL6

7、基因構建到酵母雙雜交質粒pGADT7（以下簡稱 AD）和pGBKT7（以下簡稱BK）上得到AD重組質粒pGADT7-AGL6和BK重組質粒pGBKT7-AGL6，醋酸鋰（LiAC）轉化法分別轉化酵母細胞Y187、Y2HGold得到Y187[pGADT7-AGL6]和Y2HGold[pGBKT7-AGL6]酵母轉化子，使用對應的缺陷培養(yǎng)基檢測確定酵母轉化子無毒無自激活。將含有BK重組質粒（[pGBKT7-AGL6）的Y2HGold酵母轉化

8、子細胞分別與含有AD重組質粒（pGADT7-SOC1、pGADT7-AGL24、pGADT7-SVP）的Y187酵母轉化子細胞進行融合，同時設立相應的對照。結果顯示，除陰性對照以外的陽性對照及AGL6與SOC1、AGL24、SVP三個蛋白的酵母融合細胞均能在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA（以下簡稱QDO/X/A）固體培養(yǎng)基上長出藍色酵母菌落。
　　將AGL6分別與與BiFC載體中的N、C兩端載

9、體pGPTVⅡ.YFPN、pGPTVⅡ.YFPC相連接，構建pGPTVⅡ.YFPN-AGL6和pGPTVⅡ.YFPC-AGL6載體，通過冷熱刺激法轉入農桿菌GV3101?；旌喜⒆⑸?-6片本氏煙草葉片，48小時后置于熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現共注射組合GV3101[pGPTVⅡ.YFPN-AGL6]×GV3101[pGPTVⅡ.YFPC-SOC1]、GV3101[pGPTVⅡ.YFPN-AGL6]×GV3101[pGPTVⅡ.YFPC-AG

10、L24]、GV3101[pGPTVⅡ.YFPN-AGL6]×GV3101[pGPTVⅡ.YFPC-SVP]均發(fā)出黃色熒光，說明芥菜AGL6蛋白能分別SOC1、AGL24、SVP發(fā)生相互作用。
　　4．芥菜AGL6氨基酸敲除突變體與SOC1、AGL24、SVP蛋白作用檢測
　　預測芥菜AGL6蛋白互作位點，分別構建三個氨基酸敲除突變體，AGL6D-NN（敲除第79和第80位的兩個天冬酰胺氨（NN））、AGL6D-RT（敲除第1

11、05位的精氨酸（R）和第106位蘇氨酸（T））、AGL6D-NNRT（同時敲除前面四提到的個氨基酸）。并構建酵母BK的氨基酸敲除突變體重組質粒pGBKT7-AGL6D-NN、pGBKT7-AGL6D-RT、pGBKT7-AGL6D-NNRT。將這三個含有突變體的Y2HGold酵母細胞分別與含SOC1、AGL24、SVP的Y187細胞進行融合，共9個組合，并設對照。結果表明，9個試驗組合中，只有Y2HGold[pGBKT7- AGL6D-

12、NNRT]×Y187[pGADT7-SVP]這1個組合的酵母融合二倍體不能在培養(yǎng)基QDO/X/A上產出菌落，其余8個試驗組合及所有的陽性對照均能夠在QDO/X/A產生藍色酵母菌落，陰性對照則都不能。說明氨基酸敲除突變體AGL6D-NNRT不能與SVP蛋白發(fā)生相互作用，AGL6D-NN、AGL6D-RT能與SVP發(fā)生相互作用，而AGL6D-NN、AGL6D-RT、AGL6D-NNRT均能與SOC1和AGL24發(fā)生相互作用。
　　構建

13、AGL6突變體 N端突變體質粒pGPTVⅡ.YFPN-AGL6D-NN、pGPTVⅡ.YFPN-AGL6D-RT、pGPTVⅡ.YFPN-AGL6D-NNRT。分別將含AGL6突變體的農桿菌與GV3101[pGPTVⅡ.YFPC-SVP]農桿菌混合注射浸潤煙草葉片，48小時后觀察發(fā)現GV3101[pGPTVⅡ.YFPN-AGL6D-NN]×GV3101[pGPTVⅡ.YFPC-SVP]和GV3101[pGPTVⅡ.YFPN-AGL6D-

14、RT]×GV3101[pGPTVⅡ.YFPC-SVP]組合有黃色熒光發(fā)出。組合GV3101[pGPTVⅡ.YFPN-AGL6D-NNRT]×GV3101[pGPTVⅡ.YFPC-SVP]無熒光發(fā)出，結果說明AGL6氨基酸敲除突變體AGL6D-NN、AGL6D-RT與蛋白SVP有相互作用，而AGL6氨基酸敲除突變體AGL6D-NNRT與SVP蛋白無相互作用。說明可能第79、80、105和106位上的氨基酸共同調控AGL6與SVP的相互作用

15、。
　　5.芥菜AGL15與SOC1、AGL24、SVP、AGL6蛋白互作鑒定
　　將AGL15構建到分別構建到AD和BK質粒上得到酵母重組質粒pGADT7-AGL15和pGBKT7-AGL15。將含有AGL15的Y2HGold酵母細胞分別與待鑒定的含有SOC1、AGL24、SVP及AGL6的Y187酵母細胞進行融合，總共四個試驗組合，平行設立對照試驗。試驗表明，含有AGL15的Y2HGold酵母與含有AGL24的Y187酵

16、母組合Y2HGold[pGBKT7-AGL15]×Y187[pGADT7-AGL24]的二倍體酵母細胞能夠在QDO/X/A平板上長出藍色酵母菌，剩下的三個試驗組合均不能生長，對照組試驗結果同上。
　　構建AGL15到BiFC表達載體質粒共浸潤本氏煙草葉片表皮細胞，48小時后置于熒光顯微鏡下觀察。結果顯示只有共浸潤組合為GV3101[pGPTVⅡ.YFPN-AGL15]×GV3101[pGPTVⅡ.YFPC-AGL24]的葉表皮細胞

17、觀察到了黃色熒光，其余組合無黃色熒光。說明芥菜中AGL15蛋白能與AGL24發(fā)生互作，但不能與SOC1、SVP發(fā)生互作。
　　6.芥菜AGL15氨基酸敲除突變體與AGL24互作檢測
　　在線預測 AGL15的蛋白作用位點，構建三個敲除氨基酸的突變體，分別為：AGL15D-EK(敲除第107（E）位谷氨酸和第10位賴氨酸(K))、AGL15D-R(敲除第170位精氨酸(R))、AGL15D-EKR(同時敲除以上三個氨基酸)。構

18、建三個AGL15氨基酸敲除突變體的BK酵母表達質粒pGBKT7-AGL15D-EK、pGBKT7-AGL15 D-R、pGBKT7-AGL15 D-EKR。然后分別用含有AGL24的酵母細胞Y187分別與三個突變體轉化子Y2HGold進行酵母的融合，同時設立對照，結果表明，陰性對照和陽性對照結果同上，試驗組合中Y2HGold[pGBKT7-AGL15D-EK]×Y187[pGADT7-AGL24]酵母二倍體細胞能在QDO/X/A生長并呈

19、現藍色，而二倍體酵母Y2HGold[pGBKT7-AGL15D-R]×Y187[pGADT7-AGL24]及Y2HGold[pGBKT7-AGL15D-EKR]×Y187[pGADT7-AGL24]在培養(yǎng)基QDO/X/A上無酵母長出。
　　同時構建對應的BiFC表達載體混合注射煙草表皮細胞，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現只有共侵染GV3101[pGPTVⅡ.YFPN-AGL15-A D-EK]×GV3101[pGPTVⅡ.YFPC-AGL2

20、4]的有黃色熒光產生，其余兩組均無熒光產生。由此可知芥菜AGL15氨基酸敲除突變體AGL15 D-EK能和AGL24蛋白發(fā)生相互作用，但是突變體AGL15 D-R和AGL15D-EKR均不能與蛋白AGL24發(fā)生相互作用，說明第170位氨基酸時調控AGL15與SVP蛋白相互作用的關鍵氨基酸位點。
　　7．芥菜AGL15啟動子與蛋白SOC1、AGL24、AGL15、AGL6的互作鑒定
　　構建芥菜AGL15啟動子酵母單雜重組質粒

21、pAbAi-AGL15Q，將其轉化到Y1HGold酵母得到Y1HGold(pAbAi-AGL15Q)酵母轉化子，并進行抗AbA濃度篩選。同時將構建好AD酵母重組質粒pGADT7-SOC1、pGADT7-AGL24、pGADT7-AGL15、pGADT7-AGL6質粒分別轉化（LiAC）到含有AGL15啟動子的酵母Y1HGold[pAbAi-AGL15Q]中得到Y1HGold[pAbAi-AGL15Q]+SOC1、Y1HGold[pAbA

22、i-AGL15Q]+AGL24、Y1HGold[pAbAi-AGL15Q]+AGL15都能在AbA濃度板上生長，但是Y1HGold[pAbAi-AGL15Q]+AGL6不能在AbA+150濃度板上生長。
　　同時將AGL15啟動子構建到到雙熒光素酶法載體pGreenⅡ0800-LUC上得到pGreenⅡ0800-LUC-AGL15Q。分別將啟動子載體與其他四蛋白載體轉化到農桿菌GV3101中得到GV3101[pGreenⅡ0800

23、-LUC-AGL15Q]、GV3101[pGreenⅡ62-SK-SOC1]、GV3101[pGreenⅡ62-SK-AGL24]、GV3101[pGreenⅡ62-SK-AGL15]、GV3101[pGreenⅡ62-SK-AGL6]。將GV3101[pGreenⅡ0800-LUC-AGL15Q]農桿菌分別與其他四個蛋白載體的農桿菌進行混合并注射浸入本氏煙草葉片，48小時后取材置于酶標儀下測定數值并計算。結果顯示，AGL15啟動子與S