芥菜開花調(diào)控因子FLC、SVP與SOC1基因啟動子作用區(qū)的篩選與鑒定.pdf

1、芥菜（Brassica junceaL.）是一種重要的十字花科蔬菜作物，然而目前我們對芥菜花期調(diào)控的分子機(jī)理的細(xì)節(jié)知之甚少?，F(xiàn)已知在春化途徑和自主途徑中，F(xiàn)LC起到了重要開花抑制作用，在赤霉素和光周期途徑中，SVP也能抑制開花，而位于FLC、SVP下游的SOC1，能夠整合來自多條開花途徑的調(diào)控信號，SOC1的表達(dá)受到FLC、SVP蛋白負(fù)調(diào)控。FLC和SVP蛋白都屬于MICK類型的MADS轉(zhuǎn)錄因子，它們能夠識別特定的CArG-box序列。

2、前期試驗(yàn)已經(jīng)證明，芥菜中FLC和SVP蛋白能夠識別并結(jié)合到芥菜SOC1基因啟動子（編碼區(qū)上游一段長度為782bp的DNA片段），發(fā)生蛋白質(zhì)-DNA相互作用。但是，F(xiàn)LC和SVP蛋白究竟結(jié)合到SOC1基因啟動子哪個(gè)區(qū)段，仍不清楚。因此本試驗(yàn)在已經(jīng)清楚FLC、SVP蛋白和SOC1基因啟動子之間存在相互作用的基礎(chǔ)上，利用酵母單雜交技術(shù)研究FLC、SVP蛋白與SOC1基因啟動子相互作用的結(jié)合區(qū)域及其相互作用的特異性，為SOC1基因的表達(dá)調(diào)控及其

3、開花分子機(jī)制的深入研究奠定了基礎(chǔ)。本研究主要內(nèi)容包括：
　　⑴芥菜SOC1啟動子的CArG-box分段亞克隆及其與FLC、SVP蛋白互作。獲得SOC1啟動子的分段片段:SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3，每一個(gè)小片段都含有一個(gè)CArG-box(CC[A/T]6GG)。然后將三個(gè)小片段分別連接到酵母載體質(zhì)粒pAbAi上構(gòu)建了酵母重組質(zhì)粒，再將其分別轉(zhuǎn)入酵母菌株Y1H Gold中獲得重組酵母菌Y1H[pAbAi-SOC1△1-3

4、]。篩選抑制酵母菌Y1H[pAbAi-SOC1△1-3]生長的環(huán)酯肽抗生素（Aureobasidin A，簡稱AbA）的最低濃度，得到Y(jié)1H[pAbAi-SOC1△1-3]的AbA背景濃度分別為100ng/ml、150ng/ml、100ng/ml。接著轉(zhuǎn)入實(shí)驗(yàn)室中已經(jīng)構(gòu)建好的能夠表達(dá)融合FLC、SVP蛋白的重組質(zhì)粒pGADT7FLC、pGADT7SVP，最終得到重組酵母菌Y1H[SOC1△1-3+FLC]和Y1H[SOC1△1-3+SV

5、P]。酵母單雜交表明:重組酵母菌Y1H[SOC1△1-3+FLC]和Y1H[SOC1△1-3+SVP]均能夠在含有相應(yīng)AbA背景濃度的培養(yǎng)基SD/-Leu/AbA*上正常生長。這說明酵母報(bào)告基因被激活，從而證明SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3小片段都能夠被FLC和SVP蛋白所識別并結(jié)合。
　?、平娌薙OC1啟動子的CArG-box缺失突變體與FLC、SVP蛋白互作檢測。通過分別敲除SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3小

6、片段中的CArG-box，得到了對應(yīng)的芥菜SOC1啟動子的CArG-box缺失突變體（Ⅰ型突變體），并分別命名為:Eliminate1、Eliminate2和Eliminate3。同理篩選出抑制酵母菌Y1H[pAbAi-Eliminate△1-3]生長的AbA的最低濃度，得到Y(jié)1H[pAbAi-Eliminate△1-3]的AbA背景濃度分別為100ng/ml、150ng/ml、100ng/ml。接著構(gòu)建重組酵母菌Y1H[Elimina

7、te△1-3+FLC]和Y1 H[Eliminate△1-3+SVP]。通過酵母單雜交技術(shù)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn):重組酵母菌Y1H[Eliminate△1-3+FLC]和Y1H[Eliminate△1-3+SVP]均不能夠在含有相應(yīng)AbA背景濃度的培養(yǎng)基SD/-Leu/AbA*上正常生長。這說明Eliminate1、Eliminate2和Eliminate3不能夠被FLC和SVP蛋白所識別和結(jié)合。由此推斷:SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3小片

8、段中的CArG-box均是FLC和SVP蛋白識別和結(jié)合的DNA區(qū)段。
　　⑶芥菜SOC1啟動子的CArG-box中A/T堿基互換突變體與FLC、SVP蛋白互作檢測。通過將SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3小片段中CArG-box中的A/T堿基互換，最后得到了SOC1啟動子的CArG-box中A/T堿基互換突變體（Ⅱ型突變體），分別命名為Exchange1、Exchange2和Exchange3。同理篩選抑制重組酵母菌Y1H[

9、pAbAi-Exchange△1-3]生長的AbA的最低濃度，得到Y(jié)1H[pAbAi-Exchange△1-3]的AbA背景濃度分別為100ng/ml、200ng/ml、200ng/ml。接著構(gòu)建重組酵母菌Y1H[Exchange△1-3+FLC]和Y1H[Exchange△1-3+SVP]，通過酵母單雜交技術(shù)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn):重組酵母菌Y1H[Exchange△1-3+FLC]和Y1H[Exchange△1-3+SVP]在含有相應(yīng)AbA背景濃