三鄰甲苯磷酸酯(TOCP)在小鼠成熟精子功能損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　鄰苯三甲酸酯（Tri-ortho-cresyl phosphate，TOCP）作為一種較為常見的增塑劑，廣泛地用于日常生活中，其生殖毒性也日益引起大家關(guān)注。已有研究顯示，TOCP可損傷雄性生精功能，影響精子發(fā)生。然而其對(duì)成熟精子功能是否有影響尚未見報(bào)道。本課題通過慢性染毒模型和體外孵育方法觀察 TOCP對(duì)小鼠成熟精子功能的影響，并探索精子特異性離子通道 CatSper和 Slo3在其中的作用。為揭示 TOCP等增塑劑對(duì)

2、雄性生殖系統(tǒng)損害的分子機(jī)制及為臨床診療相關(guān)生殖疾病提供新思路與新方法。
　　方法：
　　1、分別以不同劑量（0、100、200、400mg/kg/d）的TOCP灌胃建立慢性染毒小鼠模型。
　　2、通過測(cè)量染毒小鼠睪丸系數(shù)、睪丸組織的HE染色以觀察TOCP對(duì)小鼠睪丸組織的生殖毒性。
　　3、分別采用0、0.25、0.5、1mmol/L等不同濃度TOCP孵育小鼠精子1h后行體外相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
　　4、運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助

3、精子分析系統(tǒng)（CASA）觀察慢性染毒與體外孵育的小鼠精子的活率、運(yùn)動(dòng)力情況。
　　5、利用（CTC）金霉素染色法檢測(cè)慢性染毒與體外孵育小鼠精子的自發(fā)性與P4誘發(fā)性頂體反應(yīng)率的變化。
　　6、采用免疫蛋白印跡方法（Western Blot）檢測(cè)慢性染毒小鼠精子特異性鈣通道CatSper1-4和鉀通道Slo3的蛋白表達(dá)水平變化。
　　7、利用精子全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄慢性染毒與體外孵育下CatSper和Slo3通道電流（IC

4、atSper和IKsper）。
　　結(jié)果：
　　1、HE染色結(jié)果顯示，100mg/kg/d TOCP處理組的小鼠睪丸曲細(xì)精管無明顯破壞，而200mg/kg/d和400mg/kg/d TOCP處理組小鼠睪丸的曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)顯著紊亂，其生精細(xì)胞脫落，同時(shí)睪丸系數(shù)降低（P＜0.01; p＜0.001）。
　　2、CASA結(jié)果顯示，TOCP可顯著抑制慢性染毒小鼠的精子存活率和運(yùn)動(dòng)力，并有濃度依賴性。同樣，精子體外孵育1h后發(fā)現(xiàn)，

5、TOCP在一定程度上抑制精子的活率與運(yùn)動(dòng)力（P＜0.05）。
　　3、金霉素（CTC）精子染色結(jié)果表明，TOCP慢性染毒組的精子自發(fā)與P4誘發(fā)頂體反應(yīng)發(fā)生率僅在400mg/kg/d組呈顯著性差異（P＜0.05）。TOCP體外孵育0.5mmol/L組不會(huì)影響精子自發(fā)頂體反應(yīng)，但顯著抑制 P4誘發(fā)頂體反應(yīng)率（P＜0.05）。1mmol/L組則對(duì)自發(fā)和誘發(fā)頂體反應(yīng)均有顯著的抑制作用（P＜0.05）。
　　4、免疫蛋白印跡（West

6、ern Blot）檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著TOCP染毒劑量的增加，CatSper1、CatSper2、CatSper3、Slo3蛋白表達(dá)呈顯著下降，而CatSper4蛋白表達(dá)僅在400mg/kg/d組呈表達(dá)差異。
　　5、精子膜片鉗電流檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TOCP染毒對(duì)小鼠精子ICatSper呈劑量依賴式抑制（p＜0.001），在400mg/kg/d組甚至未檢測(cè)出相關(guān)電流變化；而TOCP對(duì)IKsper亦呈濃度依賴式抑制（200m