胞外ATP作用人成熟精子的機制研究.pdf

1、分類號：密級：公開UDC：學號：407324314053南昌大學碩士研究生學位論文胞外胞外ATP作用人成熟精子的機制研究作用人成熟精子的機制研究StudyingthemechanismofextracellularATPactionsonhumanmaturesperm鄒乾興培養(yǎng)單位（院、系）：生命科學學院指導教師姓名、職稱：曾旭輝教授申請學位的學科門類：理學學科專業(yè)名稱：神經生物學論文答辯日期：2017年5月28日答辯委員會主席：陳斌

2、評閱人：陳斌周文良年月日摘要I摘要人成熟精子進入女性生殖道后，需經歷一系列生理生化變化過程包括獲能、超活化運動和頂體反應等，最終才能與卵細胞完成受精。精子這些生理過程受到女性生殖道內多種生理因子的調控。其中，胞外ATP（ATPe）作為一種重要的生理調節(jié)因子被報道存在于女性生殖道中，并且體外研究表明其對人成熟精子超活化運動、頂體反應和受精能力均具有顯著促進作用。然而，ATPe作用人成熟精子生理功能的具體機制目前尚未闡明?；诎麅菴a2信號

3、在成熟精子功能調控中的核心作用，因此我們首先利用多功能酶標儀檢測ATPe對人精子胞內Ca2濃度（[Ca2]i）的影響。結果顯示ATPe（0.050.10.20.512.55mM）濃度依賴的增加[Ca2]i，并且在2.5mM時達到飽和。通過利用BAPTA將精子胞外溶液中Ca2螯合之后，發(fā)現(xiàn)ATPe不再引起精子[Ca2]i增加，表明ATPe增加的[Ca2]i來自于外Ca2內流。ATPe的效應主要由細胞膜上的P2受體介導。我們選擇兩種廣譜的P

4、2受體抑制劑PPADs和suramin，發(fā)現(xiàn)它們能顯著抑制ATPe誘導的人精子[Ca2]i增加。為驗證具體是哪種P2受體介導ATPe對人精子的效應，westernblot揭示多種P2受體包括P2X（2347）和P2Y（12）在人成熟精子中有表達。由于小鼠精子中的ATPe效應被認為是由P2X2受體通道介導，但我們利用膜片鉗技術在人精子中并未檢測到ATPe激活的P2X2電流。另外，抗體阻斷實驗結果顯示在P2X（2347）和P2Y（12）這些

5、抗體中，只有P2Y1抗體顯著抑制ATPe增加的[Ca2]i，表明ATPe對人精子的效應通過作用于P2Y1受體。由于P2Y1是一種G蛋白偶聯(lián)受體，而ATPe誘導的人精子[Ca2]i來自于外Ca2內流，因此我們猜想受ATPe激活后的P2Y1可能作用于細胞膜上的Ca2通道。精子特異的CatSper通道，因其在調控胞內Ca2信號以及精子功能中的重要作用，而成為最可能的候選Ca2通道。確實，我們發(fā)現(xiàn)ATPe能增加CatSper電流，并且CatSp

6、er抑制劑mibefradil和AR720均顯著抑制ATPe增加的[Ca2]i和CatSper電流，說明CatSper介導了ATPe誘導的人精子外Ca2內流。此外，ATPe增加的CatSper電流能被P2Y1抗體抑制；并且P2Y1和CatSper在人精子中有相似的定位，均定位在精子尾部；以及在精子胞內增加GTP濃度可以加強ATPe對CatSper電流的增加效應；表明ATPe激活CatSper是一種由P2Y1受體介導的間接作用。我們進一步