甜菜夜蛾嗅覺受體和感覺神經(jīng)元膜蛋白基因的克隆、表達(dá)定位及功能研究.pdf

1、昆蟲個體之間以及個體與環(huán)境之間的關(guān)系主要依靠化學(xué)通訊來調(diào)節(jié)，嗅覺是昆蟲主要的行為反應(yīng)模式，通過位于嗅覺組織表面的各類嗅覺感受器，昆蟲能夠感受到環(huán)境中大量的氣味信息，產(chǎn)生相應(yīng)的生理或行為反應(yīng)，如尋找寄主植物、交配產(chǎn)卵、躲避危險等。昆蟲特別是蛾類昆蟲兩性間的化學(xué)通訊具有高度的靈敏性和種特異性，根據(jù)這一特性設(shè)計的性引誘劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于害蟲的種群監(jiān)測和害蟲防治的實踐中。目前發(fā)展的害蟲引誘劑有諸多缺點，如結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、通常只能引誘雄蟲等，這對于多次

2、交配的鱗翅目害蟲防治效果并不理想，主要原因是對害蟲嗅覺識別的分子機(jī)理的研究不夠深入。研究表明在昆蟲外周感受器中有多種蛋白參與了嗅覺識別的過程，如氣味結(jié)合蛋白（Odorantbindingproteins,OBPs）、氣味降解酶(Odorantdegradingenzyme，ODEs)、氣味受體（Odorantreceptors，ORs;Ionotropicreceptors,IRs）、感覺神經(jīng)元膜蛋白（Sensoryneuronmemb

3、raneproteins，SNMPs）等，在鱗翅目中對于氣味結(jié)合蛋白的研究較多，而對于OR及SNMP的研究較少。OR位于感覺神經(jīng)樹突膜上，外界的氣味信號在這里轉(zhuǎn)化為電信號，而SNMP可能在外界氣味分子順利到達(dá)進(jìn)而激活氣味受體的過程中起重要作用。本研究針對我國重要農(nóng)業(yè)害蟲甜菜夜蛾Spodopteraexigua尋找寄主植物及雌雄個體間的交流的分子機(jī)理進(jìn)行研究，克隆了甜菜夜蛾雄蟲識別雌蟲性信息素的性信息素受體基因(OR6，OR11，OR13

4、，OR16)，通過體外表達(dá)和電生理記錄研究了這些受體的功能;克隆和鑒定了2個在甜菜夜蛾尋找寄主過程中起重要作用的氣味受體基因(OR3，OR18);克隆了2個SNMP基因并對其進(jìn)行了感器定位研究，探討了SNMP在性信息素識別過程中的可能作用。主要結(jié)果如下:
　　1、甜菜夜蛾性信息素受體基因的鑒定、表達(dá)分析和功能研究
　　通過同源克隆的方法在甜菜夜蛾觸角中獲得4個性信息素受體(PR)基因片段，進(jìn)一步通過RACE技術(shù)獲得全長，并登

5、錄到GenBank，基因名稱（GenBank登錄號）分別為SexiOR6(KC299916)、SexiOR11(KC299917)、SexiOR13(KC299918)和SexiOR16(KC299919)。進(jìn)化樹分析表明，這4個PR與已經(jīng)報道的鱗翅目昆蟲性信息素受體聚類到一個亞族。利用實時熒光定量PCR(qPCR)進(jìn)行表達(dá)水平的測定，發(fā)現(xiàn)這4個PR都在觸角中高表達(dá)，其中SexiOR6、SexiOR13和SexiOR16主要在雄蟲觸角中

6、高表達(dá)，這與雄蟲利用這些受體感受雌蟲性信息素的功能相一致;SexiOR1在雌雄蟲觸角中均高表達(dá);另外，4個基因在其它的嗅覺組織（如下唇須和喙）中也有微量表達(dá)。PR的這種表達(dá)模式與昆蟲行為反應(yīng)的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。進(jìn)一步比較這4個PR在觸角中的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，在雄蟲觸角中SexiOR6的表達(dá)量最高，約為其它3個PR的10倍左右，這與其它近緣種的幾種性信息素受體的表達(dá)量差異不一致，可能緣于昆蟲種間的差異。
　　在非洲爪蟾卵母細(xì)胞（Xeno

7、pusoocytes）分別對4個PR和Orco基因進(jìn)行共表達(dá)，并用雙電極電壓鉗記錄系統(tǒng)測定PR/Orco對性信息素組分的反應(yīng)，結(jié)果顯示，SexiOR13和SexiOR16對甜菜夜蛾的性信息素都有反應(yīng)。比較而言，SexiOR13對Z9，E12-14∶OAc和Z9-14∶OAc的反應(yīng)最大，但對Z9，E12-14∶OAc的靈敏度(EC50=3.158×10-6M)是Z9-14∶OAc(EC50=1.203×10-5M)的4倍左右。而SexiO

8、R16對Z9-14∶OH的反應(yīng)最大，靈敏度很高(EC50=9.690×10-7M)。研究結(jié)果為進(jìn)一步明確性信息素感受的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　2、甜菜夜蛾普通氣味受體基因的鑒定、定位和功能研究
　　利用同源克隆的方法從甜菜夜蛾觸角中獲得2個普通氣味受體基因片段，并通過RACE技術(shù)獲得全長cDNA。2個基因名稱（GenBank登錄號）分別為SexiOR3(JF747606)和SexiOR18(JN873314)。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)

9、，這2個OR屬于龐大的普通氣味受體亞家族。qPCR測定發(fā)現(xiàn)，2個普通氣味受體主要在觸角中表達(dá)，但不同于性信息素受體的是，它們在雌蟲觸角中的表達(dá)量顯著高于雄蟲觸角。利用原位雜交技術(shù)（insituhybridization）定位了這2個基因以及Orco基因在成蟲觸角中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SexiOR3主要在短毛形感器下表達(dá)，長毛形感器下少量表達(dá)而在腔錐形感器和刺形感器下沒有表達(dá);SexiOR18主要在毛形感器（包括長毛形感器和短毛形感器）和錐形感器

10、下表達(dá)，而在腔錐形感器和刺形感器下不表達(dá);SexiOrco基因的表達(dá)比較廣泛，在毛形感器、錐形感器、腔錐形感器下都有表達(dá)，但在栓錐形感器和刺形感器中沒有表達(dá)。
　　利用非洲爪蟾卵母細(xì)胞進(jìn)行異源表達(dá)SexiOR3和SexiOR18，然后用雙電極電壓鉗記錄系統(tǒng)測定了3個OR對62種植物氣味的反應(yīng)。結(jié)果表明，SexiOR3僅對E-β-法尼烯、法尼醇、橙花叔醇、香葉醇和己酸壬酯有明顯的反應(yīng)，其中對E-β-法尼烯的反應(yīng)最強(qiáng)，EC50=3.5

11、99×10-7M。進(jìn)一步篩選發(fā)現(xiàn)苯乙醛能顯著抑制SexiOR3對E-β-法尼烯的反應(yīng)，且在高濃度時抑制作用更強(qiáng)，而對其它幾種能引起SexiOR3反應(yīng)的化合物沒有抑制作用，推測苯乙醛是SexiOR3識別E-β-法尼烯的抑制劑。SexiOR18對所測定的普通氣味均無反應(yīng)，其功能有待于進(jìn)一步研究。
　　3、甜菜夜蛾感覺神經(jīng)元膜蛋白基因的克隆、序列分析和表達(dá)水平研究
　　利用同源克隆的方法從甜菜夜蛾觸角中獲得2個感覺神經(jīng)元膜蛋白基因

12、的開放閱讀框全長，基因名稱（GenBank登錄號）分別為SexiSNMP1JX469106）和SexiSNMP2(JX469107)。將2個SNMP進(jìn)行進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，兩者分別屬于SNMP1和SNMP2亞組，兩者間的氨基酸相似度僅29％。qPCR測定發(fā)現(xiàn)，SexiSNMP1在成蟲觸角中特異性表達(dá);SexiSNMP2除在成蟲觸角中高表達(dá)外，在喙和下唇須等組織中也有少量表達(dá)。2個SexiSNMP相比較，在雄蟲觸角中SexiSNMP2的表達(dá)量

13、顯著高于SexiSNMP1，而在雌蟲觸角中兩者沒有差異。利用原位雜交技術(shù)定位了這2個基因在雌雄觸角中的感器分布，結(jié)果顯示，SexiSNMP1和SexiSNMP2在毛形感器和錐形感器下都有表達(dá)，暗示這2個基因不僅參與感受性信息素而且還參與普通氣味的識別。
　　綜上所述，本文首次從甜菜夜蛾的觸角中克隆了6個氣味受體基因和2個感覺神經(jīng)元膜蛋白基因，測定了這些基因的表達(dá)特征，并初步研究了這些基因在性信息素組分及62種普通氣味感受中的功能。