HBV表面抗原大蛋白與人胰腺CDK5RAP3蛋白相互作用的初步研究.pdf

1、目的：為進(jìn)一步研究HBV表面抗原大蛋白（LHBs）與宿主胰腺細(xì)胞的相互作用。方法：1.將酵母細(xì)胞表達(dá)載體pGBKT7-LHBs轉(zhuǎn)化AH109酵母菌株，與含有胰腺細(xì)胞文庫(kù)質(zhì)粒的Y187酵母菌株進(jìn)行配合，行酵母雙雜交，篩選人胰腺中LHBs結(jié)合蛋白基因。2.應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse transcription PCR，RT-PCR），擴(kuò)增人胰腺CDK5RAP3基因。3.構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-3.1 -myc-his-CDK

2、5RAP3, 通過真核表達(dá)系統(tǒng)，應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)及Western blotting方法證實(shí)LHBs與人胰腺CDK5RAP3蛋白在細(xì)胞內(nèi)的相互作用關(guān)系。4.構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pACT-CDK5RAP3，通過真核表達(dá)系統(tǒng)，應(yīng)用哺乳動(dòng)物雙雜交技術(shù)證實(shí)LHBs與人胰腺CDK5RAP3蛋白在細(xì)胞內(nèi)的相互作用關(guān)系。5.構(gòu)建CDK5RAP3的紅色熒光表達(dá)載體pDsRed1-N1-CDK5RAP3，將其與綠色熒光表達(dá)載體pEGFP-LHBs分別轉(zhuǎn)染Ca

3、pan2細(xì)胞，模擬該蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察LHBs及CDK5RAP3蛋白的亞細(xì)胞定位。結(jié)果：1.成功篩選出人胰腺細(xì)胞中11種與LHBs存在相互作用的已知功能蛋白，其中包括羧肽酶B1、胰凝乳蛋白C、人類胰蛋白酶原2、線粒體蛋白基因、組織相容性復(fù)合體13、烏頭酸酶1、蛋白酶2、輔脂肪酶以及核糖體蛋白L10a等已知功能蛋白。2.成功擴(kuò)增人胰腺CDK5RAP3基因。3.成功構(gòu)建CDK5RAP3基因的真核表達(dá)載體pcDNA3

4、.1-myc-his-CDK5RAP3，同pcDNA3.1(-)LHBs行免疫共沉淀，證實(shí)LHBs與人胰腺CDK5RAP3蛋白在細(xì)胞內(nèi)存在相互作用關(guān)系。4.成功構(gòu)建CDK5RAP3基因的真核表達(dá)載體pACT-CDK5RAP3，同pBIND-LHBs等共轉(zhuǎn)染Capan 2細(xì)胞，行哺乳動(dòng)物雙雜交，證實(shí)LHBs與人胰腺CDK5RAP3蛋白在細(xì)胞內(nèi)存在相互作用關(guān)系。5.成功構(gòu)建CDK5RAP3的紅色熒光表達(dá)載體，并在Capan2細(xì)胞中得到表達(dá)。