基于恒溫擴增和DNA納米技術(shù)對生物活性物質(zhì)檢測的新方法研究.pdf

1、生物傳感器是由生物活性材料（如多肽、核酸、抗體、細胞、組織等）、換能器以及信號處理裝置構(gòu)成的分析裝置或器件。近年來，隨著分子生物學、材料科學、生物分析化學、臨床檢驗診斷學等不斷發(fā)展，恒溫擴增和DNA納米技術(shù)的介入為生物傳感器的發(fā)展提供了新的活力。能夠?qū)Χ喾N生物活性物質(zhì)（細胞、細菌、核酸、無機離子、多肽、小分子物質(zhì)等）進行快速、靈敏、特異、準確的檢測。本研究主要基于恒溫擴增和DNA納米技術(shù)對可卡因和miRNA檢測方法進行研究，所建立的方法

2、能夠準確、快速、超靈敏檢測可卡因和miRNA，為臨床疾病診斷、法醫(yī)毒物分析和環(huán)境監(jiān)測等提供有力的工具。研究內(nèi)容分為以下兩部分：
　　1.基于超分子適體和滾環(huán)擴增的電化學傳感器對可卡因高靈敏檢測
　　可卡因是當今世界主要的成癮性藥物之一,并且對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有很強刺激作用，對可卡因進行定性定量分析在法醫(yī)毒物分析、藥理學、代謝組學中具有重要意義。因此，急需發(fā)展簡便、快速、超靈敏的可卡因檢測新方法。本研究整合超分子適體、滾環(huán)擴增及生

3、物素和鏈酶親和素信號放大策略，以電化學生物傳感器為平臺，建立一種可卡因檢測新技術(shù)新方法。可卡因適體被拆分成兩個片段，在靶物質(zhì)可卡因存在的條件下，固定在電極表面適體片段和另外一個生物素標記的適體片段結(jié)合，形成超分子適體，接著加入鏈酶親和素和生物素標記環(huán)化DNA。在phi29 DNA聚合酶和dNTPs存在下啟動滾環(huán)擴增，從而產(chǎn)生大量串聯(lián)重復序列。然后鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶與電極上剩余的生物素標記的檢測探針結(jié)合，引起酶聯(lián)信號放大，此信號隨

4、著可卡因濃度的增加而增大。雙重信號放大策略極大提高適體傳感器靈敏度。在最優(yōu)的條件下，電化學信號與可卡因的濃度在2 nM-500 nM的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，最低檢測限為1.3 nM（信噪比為3）。此外，所建立的生物傳感方法能夠?qū)δ蛞簶颖局械目煽ㄒ蜻M行直接檢測，其結(jié)果與傳統(tǒng)的GC-M S相符合。
　　2.基于鏈置換擴增和DNA納米技術(shù)對microRNA超靈敏檢測
　　MiRNA是一類內(nèi)源性非編碼的小分子 RNA，其異常表

5、達與相關(guān)腫瘤的早期診斷、療效檢測及預后判斷等密切相關(guān)。因此，發(fā)展靈敏、特異、簡便、快速的miRNA檢測新方法具有十分重要的意義。本研究整合鏈置換擴增反應和具有DNA酶的催化莖環(huán)自組裝技術(shù)，建立通用型比色生物傳感器用于miRNA超靈敏檢測。在靶物質(zhì)miRNAs存在的條件下，誘發(fā)鏈置換擴增反應，從而釋放DNA片段，均相擴增DNA產(chǎn)物啟動CHA，接著生成大量CHA產(chǎn)物。同時CHA產(chǎn)物與hemin結(jié)合形成G-四聯(lián)體-hemin DNA酶，其具有