hBMP-7的定點突變及其在甲醇酵母中的表達鑒定.pdf

1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenesis Proteins,BMPs)是一類蛋白質生長因子,在動物(包括人類)的生長發(fā)育過程中對組織器官的決定與分化起重要作用.骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP7)又稱成骨蛋白-1(Osteogenic Protein-1,OP-1)具有促使細胞組織分化形成骨組織的作用.該研究嘗試建立hBMP7成熟片段在畢赤酵母(Pichiapastoris)中的表達技術.主要研究工作包括:將hBMP7全長cDNA

2、的成熟片段克隆到分泌型表達載體質粒pPIC9K多克隆位點上,構建能表達hBMP7成熟肽的載體質粒;以這一表達載體為基礎,依據(jù)酵母密碼子使用偏好性,將hBMP7成熟片段內3個酵母使用頻率為O的精氨酸密碼子突變?yōu)槭褂妙l率較高的同義密碼子AGA,以期實現(xiàn)高效表達;表達質粒經(jīng)轉化酵母宿主菌株KM71,PCR鑒定基因整合后,搖瓶培養(yǎng),甲醇誘導表達并用點雜交快速篩選高表達菌株.搖瓶表達上清經(jīng)Tricine-PAGE分析表明在18KD處有一新增條帶;

3、Western-Blotting表明該條帶具有良好的抗原性和特異性,證實為hBMP7,重組產(chǎn)物的理論分子量為15.6KD,實際值為18KD,推測產(chǎn)物帶有一定程度的糖基化修飾,重組產(chǎn)物以單體形式存在,沒有檢測到預期的二聚體形式.利用蛋白質Bradford總蛋白定量,結合Glyko BandScan量化軟件的分析發(fā)現(xiàn),表達上清中特異性蛋白的表達量可達到25.45μg/ml,占總蛋白含量的76.2％;密碼子優(yōu)化使rhBMP7搖瓶培養(yǎng)表達量較未