hBMP-4在畢赤酵母中的表達、純化、活性鑒定及二聚體化研究.pdf

1、福建師范大學碩士學位論文hBMP4在畢赤酵母中的表達、純化、活性鑒定及二聚體化研究姓名：鄭彬瓊申請學位級別：碩士專業(yè)：發(fā)育生物學指導教師：張彥定20090601中文文摘中文文摘目前常用的重組蛋白表達系統(tǒng)有大腸桿菌系統(tǒng)、活性桿狀病毒系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)以及哺乳動物細胞表達系統(tǒng)等。近來快速發(fā)展起來的巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)表達系統(tǒng)由于其具備高效表達、高遺傳穩(wěn)定性、分子遺傳學操作簡單而且作為一個真核表達載體，能夠對目的蛋白

2、進行翻譯后加工和修飾等優(yōu)點而被廣泛應用。根據(jù)需要可進行胞內或者是胞外分泌型表達，胞外分泌型表達純化工藝簡易、生產成本低可進行工業(yè)化生產。在具有眾多優(yōu)點的同時，畢赤酵母也有一些缺點，包括分泌型蛋白容易被蛋白酶水解；糖基化形式與人類存在著差異等。外源蛋白在巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)內是否能夠實現(xiàn)高效表達還受到很多因素的影響。其中包括外源基因的密碼子組成；外源基因的拷貝數(shù)；宿主菌表型；表達載體和啟動子；分泌信號肽；mRNA的二級結構；發(fā)酵條件等。

3、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BoneMorphogeneticProteins，BMPs)是一類蛋白質生長因子，BMPs能夠強烈誘導骨和軟骨的形成而且在早期骨骼發(fā)育中有著重要作用。其中骨形態(tài)發(fā)生蛋白4又稱骨形態(tài)發(fā)生蛋白2B，BMP4不僅在胚胎發(fā)育早期對眼睛的發(fā)育起著關鍵的作用而且在出生后甚至到成人都對視網(wǎng)膜的發(fā)育有著重要作用。已有實驗表明BMP4在體內具有誘導異位成骨能力，BMP4是造血細胞和神經細胞的分化因子，也能夠誘導C2C12細胞系朝成骨分化

4、。hBMP4基因位于人類的第14號染色體上，cDNA全長是1224bp，它編碼408個氨基酸構成的前前體蛋白，包括信號肽(第119位氨基酸)，前導肽(第20292位氨基酸)，成熟肽(第293408位氨基酸)三部分。hBMP4在人細胞內是以前前體蛋(j(preproprotein)的形式合成的，在成熟肽的N端有被FURIN識別的呻AKR一位點，F(xiàn)URIN把前導肽從成熟肽的N端切離，從而把前體蛋白加工為116個氨基酸的成熟蛋白。hBMP4成

5、熟蛋白帶有2個N糖基化位點(第350和365位氨基酸)，并含有TGFD家族共有的7個半胱氨酸的保守區(qū)，其中6個半胱氨酸殘基形成3對分子內二硫鍵，第7個(第372位氨基酸)半胱氨酸殘基通過分子間二硫鍵介導hBMP4同型或異型二聚體的形成。分子伴侶是一類能夠幫助其它大分子正確折疊、去折疊、組裝、去組裝但并不是這些大分子最終結構的組成成分的蛋白總稱，它的底物包括蛋白質和RNA。某些蛋白的前導肽也具有類似分子伴侶的功能即能夠輔助成熟肽的正確折疊