hBMP-4在畢赤酵母中的表達(dá)、純化、活性鑒定及二聚體化研究.pdf

1、福建師范大學(xué)碩士學(xué)位論文hBMP4在畢赤酵母中的表達(dá)、純化、活性鑒定及二聚體化研究姓名：鄭彬瓊申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：發(fā)育生物學(xué)指導(dǎo)教師：張彥定20090601中文文摘中文文摘目前常用的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌系統(tǒng)、活性桿狀病毒系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等。近來快速發(fā)展起來的巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)系統(tǒng)由于其具備高效表達(dá)、高遺傳穩(wěn)定性、分子遺傳學(xué)操作簡單而且作為一個(gè)真核表達(dá)載體，能夠?qū)δ康牡鞍?/p>

2、進(jìn)行翻譯后加工和修飾等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。根據(jù)需要可進(jìn)行胞內(nèi)或者是胞外分泌型表達(dá)，胞外分泌型表達(dá)純化工藝簡易、生產(chǎn)成本低可進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。在具有眾多優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，畢赤酵母也有一些缺點(diǎn)，包括分泌型蛋白容易被蛋白酶水解；糖基化形式與人類存在著差異等。外源蛋白在巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)是否能夠?qū)崿F(xiàn)高效表達(dá)還受到很多因素的影響。其中包括外源基因的密碼子組成；外源基因的拷貝數(shù)；宿主菌表型；表達(dá)載體和啟動(dòng)子；分泌信號肽；mRNA的二級結(jié)構(gòu)；發(fā)酵條件等。

3、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BoneMorphogeneticProteins，BMPs)是一類蛋白質(zhì)生長因子，BMPs能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)骨和軟骨的形成而且在早期骨骼發(fā)育中有著重要作用。其中骨形態(tài)發(fā)生蛋白4又稱骨形態(tài)發(fā)生蛋白2B，BMP4不僅在胚胎發(fā)育早期對眼睛的發(fā)育起著關(guān)鍵的作用而且在出生后甚至到成人都對視網(wǎng)膜的發(fā)育有著重要作用。已有實(shí)驗(yàn)表明BMP4在體內(nèi)具有誘導(dǎo)異位成骨能力，BMP4是造血細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的分化因子，也能夠誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞系朝成骨分化

4、。hBMP4基因位于人類的第14號染色體上，cDNA全長是1224bp，它編碼408個(gè)氨基酸構(gòu)成的前前體蛋白，包括信號肽(第119位氨基酸)，前導(dǎo)肽(第20292位氨基酸)，成熟肽(第293408位氨基酸)三部分。hBMP4在人細(xì)胞內(nèi)是以前前體蛋(j(preproprotein)的形式合成的，在成熟肽的N端有被FURIN識別的呻AKR一位點(diǎn)，F(xiàn)URIN把前導(dǎo)肽從成熟肽的N端切離，從而把前體蛋白加工為116個(gè)氨基酸的成熟蛋白。hBMP4成

5、熟蛋白帶有2個(gè)N糖基化位點(diǎn)(第350和365位氨基酸)，并含有TGFD家族共有的7個(gè)半胱氨酸的保守區(qū)，其中6個(gè)半胱氨酸殘基形成3對分子內(nèi)二硫鍵，第7個(gè)(第372位氨基酸)半胱氨酸殘基通過分子間二硫鍵介導(dǎo)hBMP4同型或異型二聚體的形成。分子伴侶是一類能夠幫助其它大分子正確折疊、去折疊、組裝、去組裝但并不是這些大分子最終結(jié)構(gòu)的組成成分的蛋白總稱，它的底物包括蛋白質(zhì)和RNA。某些蛋白的前導(dǎo)肽也具有類似分子伴侶的功能即能夠輔助成熟肽的正確折疊