hBMP-7在畢赤酵母中高效表達(dá)及二聚體化研究.pdf

1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Motphogenetic Proteins，BMPs)屬于TGF-B家族的一類蛋白質(zhì)生長(zhǎng)因子，其中hBMP-7(又稱OP-1)，除了具有常位/異位誘導(dǎo)骨形成的作用以外，在發(fā)育過程中還能對(duì)多種組織器官的發(fā)生、發(fā)育起到重要的調(diào)節(jié)作用。因此，hBMP7在闡明多種組織器官的發(fā)生、發(fā)育分子機(jī)制的研究及在臨床上具有廣泛的應(yīng)用前景。巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)是近年發(fā)展起來并被廣泛運(yùn)用的一種優(yōu)良

2、的真核表達(dá)系統(tǒng)。本研究利用此表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)hBMP-7，探討在此表達(dá)系統(tǒng)中提高h(yuǎn)BMP-7基因的拷貝數(shù)能否提高h(yuǎn)BMP-7表達(dá)量，以及研究在此表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)高生物活性的hBMP-7二聚體蛋白的可行性。 主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)論如下： 1、改造hBMP-7成熟肽的密碼子，將酵母使用頻率較低的密碼子突變?yōu)槭褂妙l率較高的密碼子，然后在hBMP-7成熟肽的N端帶上a-factor的前-前導(dǎo)肽，接著構(gòu)建表達(dá)載體pAO815-a-facto

3、r-BMP7m-1c(1拷貝)，在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建多拷貝hBMP-7成熟肽的表達(dá)質(zhì)粒。將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GS115菌株，并進(jìn)行搖瓶表達(dá)目的蛋白的實(shí)驗(yàn)，取上清經(jīng)DOT-BLOT快速半定量檢測(cè)，初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著hBMP-7成熟肽基因拷貝數(shù)的增加，hBMP-7成熟肽在酵母中的表達(dá)量也增多。 2、把hBMP-7中FURIN識(shí)別的序列-RSIR-，應(yīng)用SOEPCR的方法進(jìn)行定點(diǎn)突變，改為酵母的Kex2p識(shí)別的序列-KR-，接著構(gòu)建pPI

4、C9K-BMP-7pmk表達(dá)載體。表達(dá)載體轉(zhuǎn)化GS115菌株后，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)表達(dá)目的蛋白的實(shí)驗(yàn)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)DOT-BLOT和WESTERN-BLOT分析，初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物中無hBMP-7二聚體蛋白，說明用這種方法在酵母表達(dá)系統(tǒng)中無法獲得hBMP-7二聚體蛋白。 3、利用pfuDNA聚合酶將hBMP-7的前導(dǎo)肽與成熟肽的基因擴(kuò)增出來，構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9K-BMP-7pm；構(gòu)建表達(dá)載體pAO815-Furin；接著將