家蠶磷酸吡哆醇氧化酶的體外定點(diǎn)突變及其活性鑒定.pdf

1、維生素B6(VB6)是一種水溶性維生素，也是一類(lèi)吡啶化合物的總稱(chēng)，2-甲基-3-羥基-5-羥甲基吡啶是它們共同的母體，吡啶環(huán)第四碳位被羥甲基、氨甲基、甲?；〈蠓謩e形成吡哆醇（Pyridoxine，PN）、吡哆胺（Pyridoxamine，PM）和吡哆醛（Pyridoxal,PL），三者相應(yīng)磷酸酯形式為磷酸吡哆醇（Pyridoxine-5’-phosphate，PNP）、磷酸吡哆胺（Pyridoxine-5’-phosphate，PM

2、P）和磷酸吡哆醛（Pyridoxal-5’-phosphate，PLP），其中PLP是VB6的主要輔酶形式。PLP是氨基酸代謝過(guò)程中多種酶的重要輔酶，參加催化氨基酸的各種代謝反應(yīng)，在氨基酸的合成、分解和轉(zhuǎn)換代謝中具有重要作用。PLP的生物合成方式包括從頭合成途徑和補(bǔ)救途徑兩種。補(bǔ)救途徑中磷酸吡哆醇氧化酶（Pyridoxine-5’-phosphate oxidase，PNPO）發(fā)揮關(guān)鍵作用。PNPO在黃素單核苷酸（Flavin mono

3、nuleotide，F(xiàn)MN）和O2 存在下，可氧化底物PNP和PMP 上的醇基或氨基為醛基，生成PLP。
　　 家蠶是鱗翅目昆蟲(chóng)基因組和基因研究的主要模型，也是僅次于果蠅作為昆蟲(chóng)基因研究的代表。家蠶的功能基因研究不僅有助于闡明同源基因的功能，而且將推動(dòng)有關(guān)昆蟲(chóng)的馴化、形態(tài)發(fā)生、內(nèi)分泌、繁殖、行為和免疫等研究進(jìn)程。在家蠶體內(nèi)絲蛋白的合成和生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中，VB6 代謝是其中一個(gè)重要環(huán)節(jié)。PNPO是僅有的可以將氨基或醇基氧化成醛基的

4、黃素蛋白氧化酶，在VB6的代謝過(guò)程中，可能是一個(gè)關(guān)鍵控制點(diǎn)。
　　 本文以本實(shí)驗(yàn)室保存的家蠶PNPO cDNA為研究對(duì)象，分別對(duì)Lys111和Ser160進(jìn)行定點(diǎn)突變，將賴(lài)氨酸突變?yōu)楣劝彼幔洖镵-E；絲氨酸突變成丙氨酸，記作S-A。通過(guò)重組表達(dá)和體外酶活測(cè)定，鑒定該位點(diǎn)的功能。家蠶重組PNPO 突變體經(jīng)SDS-PAGE 檢測(cè)蛋白分子量約在45.0 kDa，與突變前的蛋白分子量一致。經(jīng)體外酶促反應(yīng)測(cè)定，K-E 突變體的酶活性降低