粗糙脈孢菌漆酶基因的克隆、定點(diǎn)誘變及其在畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、漆酶(laccase)是一類含銅的多酚氧化酶，它以氧作為終電子受體，能催化許多化合物的氧化反應(yīng)，其作用底物比較廣泛，包括酚類及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等。漆酶在造紙工業(yè)、紡織工業(yè)、環(huán)境保護(hù)、生物資源利用、有毒環(huán)境污染物轉(zhuǎn)化和新能源開發(fā)等諸多領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。粗糙脈孢菌Neurosporacrassa產(chǎn)生的漆酶(NCL)是一種有代表性的子囊菌漆酶，具有較好的耐熱性能，最適作用pH為6(以愈創(chuàng)木酚為底物測定酶活)，

2、其編碼基因中只有一個內(nèi)含子。本文主要研究NCL的基因工程菌構(gòu)建、NCL的最適pH值定點(diǎn)誘變改造、NCL改造后的酶學(xué)性質(zhì)以及NCL基因突變體的發(fā)酵條件。 采用連續(xù)延伸PCR技術(shù)從N.crassa染色體DNA中擴(kuò)增出不含信號肽序列的NCL結(jié)構(gòu)基因，將該結(jié)構(gòu)基因插入巴斯德畢赤酵母Pichiapastoris分泌型表達(dá)載體pPIC9K的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成能夠在P.pastoris胞外表達(dá)NCL基因的重組質(zhì)粒pPIC9K/lacc，重組質(zhì)

3、粒以SacⅠ線性化后電轉(zhuǎn)化尸.pastorisKM71。重組畢赤酵母在甲醇誘導(dǎo)下表達(dá)出NCL活性，最高酶活為2.94U/mL。SDS-PAGE結(jié)果顯示重組畢赤酵母分泌表達(dá)的NCL分子量約為64.8kD。 設(shè)計(jì)引物時將NCL結(jié)構(gòu)基因中的Val(纈氨酸)、Ser(絲氨酸)、Gly(甘氨酸)對應(yīng)的堿基替換為Leu(亮氨酸)、His(組氨酸)、Met(蛋氨酸)對應(yīng)的堿基，同樣采用連續(xù)延伸PCR技術(shù)從重組質(zhì)粒pPIC9K/lacc中擴(kuò)增出

4、NCL誘變基因。將NCL誘變基因插入P.pastoris分泌型表達(dá)載體pPIC9K的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成能夠在P.pastoris胞外表達(dá)NCL誘變基因的重組質(zhì)粒pPIC9K/lacc′，重組質(zhì)粒以SacⅠ線性化后電轉(zhuǎn)化P.pastorisKM71。重組畢赤酵母在甲醇誘導(dǎo)下表達(dá)出NCL活性，酶活與定點(diǎn)誘變前相比沒有提高。 粗糙脈孢菌漆酶基因突變體和重組野生菌的發(fā)酵液8000r/min冷凍離心10min，取上清，冷凍干燥，加入10m

5、L雙蒸水溶解。再經(jīng)過三次SephadexG-15凝膠柱和一次DEAESepharoseCL-6B凝膠柱層析分離處理，分別得到了重組突變酶和重組野生酶的純酶溶液。SDS-PAGE結(jié)果顯示純化后的重組突變酶、重組野生酶均達(dá)到電泳均一，分子量約為64.8kD。酶學(xué)性質(zhì)研究表明，重組突變酶的最適作用pH值由偏酸變?yōu)槠珘A，pH穩(wěn)定范圍向堿性擴(kuò)大，而重組突變酶的其他酶學(xué)性質(zhì)(最適作用溫度、熱穩(wěn)定性、金屬離子的影響、潛在酶抑制劑的影響等)與重組野生酶

6、相比沒有改變。 系統(tǒng)研究了粗糙脈孢菌漆酶基因突變體在菌體生長和誘導(dǎo)表達(dá)兩個階段的搖瓶發(fā)酵條件。采用優(yōu)化的碳源(20g/L的葡萄糖)、氮源(20g/L的玉米漿)，以培養(yǎng)基初始pH5.5，接種量2.5％，于220r/min、30℃下?lián)u瓶培養(yǎng)N.crassa漆酶基因突變體，至第4天時，生物量達(dá)到最高值，OD600為5.362，比初始發(fā)酵條件下提高約20％；采用優(yōu)化的碳源(0.5％甲醇)、氮源(20g/L玉米漿)，以培養(yǎng)基初始pH5.5