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文檔簡介
1、IFN-λs是最新發(fā)現(xiàn)的一類具有抗病毒活性的干擾素樣細胞因子,包括IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28A)和IFN-λ3(IL-28B)。IFN-λs在基因結(jié)構(gòu)上與IL-10家族十分相似,而在氨基酸組成和功能方面與Ⅰ型IFN更為接近,在IL-10家族和Ⅰ型IFN之間建立了進化上的聯(lián)系。IFN-λs,尤其是IFN-λ1,具有開發(fā)成廣譜抗病毒藥物的潛在價值,為此開展了該干擾素基因的克隆、表達、生物活性檢測和有關(guān)信號蛋白相互作
2、用的研究。 本論文中通過RT-PCR從人外周血淋巴細胞中克隆了IFN-λ1cDNA,其序列與GenBank的報道有一個堿基的差異,但氨基酸序列完全一致。為了大量獲得IFN-λ1蛋白,IFN-λ1cDNA先后被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌和酵母表達體系中。在大腸桿菌中,IFN-λ1的表達水平極低,這可能與密碼子偏愛性或IFN-λ1對大腸桿菌的毒性有關(guān)。隨后IFN-λ1cDNA以串聯(lián)多拷貝的形式轉(zhuǎn)化到甲醇營養(yǎng)酵母Pichiapastoris中,并
3、通過α因子前導肽分泌到胞外,表達水平約為28mg/L。理論上,重組IFN-λ1(rhIFNλ1)前體蛋白將受到酵母KEX2蛋白酶的切割,釋放出與天然IFN-λ1一級結(jié)構(gòu)完全相同的重組蛋白。但WesternBlotting和氨基酸測序發(fā)現(xiàn)rhIFN-λ1受到不明蛋白酶的加工,產(chǎn)生了具有不同N末端的三種蛋白,其中兩種蛋白N端帶有殘留的α因子前導肽序列,第三種蛋白N端缺失了13個氨基酸殘基。這可能是因為IFN-λ1的N末端氨基酸Pro屬于強剛
4、性氨基酸,抑制了KEX2在其識別序列DKR羧基端的剪切。用FPLCSPSepharoseFastFlow層析柱純化了rhIFN-λ1,回收率大于70%。純化的蛋白能夠有效上調(diào)Hela細胞內(nèi)磷酸化STAT1(pY-STAT1)的水平,表明IFN-λ1的N端缺失或冗余不會對激活STAT1造成太大的影響。 IFN-λs受體隸屬于Ⅱ型細胞因子受體家族(CRF2),由兩個亞基構(gòu)成,即CRF2-12和CRF2-4。其中CRF2-12是IFN
5、-λs受體特有的亞基,CRF2-4最早是作為IL-10受體(IL-10R)的小亞基被發(fā)現(xiàn)的,故又稱為IL-10R2,同時CRF2-4還是IL-22R和IL-26R的共有亞基。通過氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),CRF2-12胞內(nèi)區(qū)含有一個TRAF6結(jié)合位點,并有眾多的激酶位點。為了驗證CRF2-12與TRAF6的相互作用,我們構(gòu)建了原核表達載體pGEX-6P-TRAF6和真核表達載體pCMV-Myc-CRF2-12、pBudCE4-TRAF6,并從
6、體內(nèi)和體外兩方面對CRF2-12與TRAF6的相互作用作了驗證。GSTpul1-down試驗證明CRF2-12可直接與TRAF6結(jié)合,雙向免疫共沉淀試驗也證實了CRF2-12與TRAF6之間存在特異的相互作用。同時,胞內(nèi)試驗還發(fā)現(xiàn),當與TRAF6共表達時,CRF2-12的表達水平顯著上升,表明TRAF6可促進CRF2-12的表達或增加CRF2-12的穩(wěn)定性。進一步的實驗發(fā)現(xiàn),無論是否共轉(zhuǎn)染了TRAF6基因,293T細胞內(nèi)CRF2-12的
7、mRNA含量維持在相對穩(wěn)定的水平,因此,TRAF6并非CRF2-12的轉(zhuǎn)錄激活因子。在CRF2-12和TRAF6充分表達后,使用高濃度放線菌酮抑制兩種蛋白的繼續(xù)合成,WesternBlotting證明TRAF6可明顯延長CRF2-12蛋白的半衰期,這可能是因為TRAF6結(jié)合后封閉了CRF2-12的一些蛋白酶作用位點,從而降低了CRF2-12降解的速度。 上述研究結(jié)果為促進IFN-λ1的應(yīng)用研究,為開展IFN-λ1的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)
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