云芝糖肽高產(chǎn)菌株的選育及其發(fā)酵工藝研究.pdf

1、云芝是一種藥用真菌，從其菌絲體中提取的云芝糖肽是一種具有抗腫瘤活性的藥物，它能顯著提高機(jī)體的免疫力，適用于癌癥的輔助治療。本文將從菌株優(yōu)選、發(fā)酵工藝優(yōu)化和菌絲形態(tài)學(xué)觀察三個方面優(yōu)化云芝糖肽的生產(chǎn)工藝，提高云芝糖肽的產(chǎn)量。
　　 通過人工代料栽培獲得成熟的云芝子實體，分離云芝孢子，制成孢子懸液，接種到PDA培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)，分離獲得大量菌株。將不同菌株接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48小時，再轉(zhuǎn)接一定量的菌塊至PDA培養(yǎng)基上，在平

2、板上比較菌落生長速度和菌落形態(tài)進(jìn)行初篩，分別選出色白、生長速度快、菌絲致密厚實、氣生菌絲多的菌株。再進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)復(fù)篩，以出發(fā)菌株為參照，以菌絲體得率、云芝糖肽得率以及云芝糖肽的糖含量、蛋白含量為指標(biāo)篩選云芝糖肽高產(chǎn)菌株。經(jīng)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，獲得一株云芝糖肽高產(chǎn)菌株P(guān)T00407，其菌絲體得率最高，為17.1±0.09g/L比出發(fā)菌株Cov-1提高了23.0％，該菌株的云芝糖肽得率為1.32g/L，比出發(fā)菌株Cov-1提高了18.9％。<

3、br>　　 云芝孢子在PDA平板上萌發(fā)后，其菌落形態(tài)差異巨大，有很多菌落的形態(tài)特征與出發(fā)菌株Cov-1有所不同，同時在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的菌絲球形態(tài)也有所不同。通過將篩選得到的具有不同菌落形態(tài)的典型菌株進(jìn)行液體發(fā)酵，發(fā)酵液分離提取云芝糖肽，同時將菌絲球制成石蠟切片，觀察其形態(tài)特征。結(jié)果不同菌株菌絲球的形態(tài)特征也具有顯著差異，且菌絲體得率、云芝糖肽得率及糖含量和單糖組分也有較大差異。其中菌落致密厚實、氣生菌絲最多的PT00407菌株的云芝

4、糖肽產(chǎn)量最高，總糖含量和葡萄糖的摩爾百分比最高。為了研究液體發(fā)酵時間與菌絲球形態(tài)、云芝糖肽產(chǎn)量、質(zhì)量之間的關(guān)系，考察了云芝液體發(fā)酵的種子液以及發(fā)酵30、60、66、72小時的菌絲球形態(tài)、云芝糖肽得率及其糖含量的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時間的延長，云芝糖肽的得率大幅增加，云芝糖肽中的糖含量逐漸降低，綜合考慮產(chǎn)量和質(zhì)量因素，最終確定最佳發(fā)酵發(fā)酵時間為72小時，此時云芝糖肽得率為1.5g/L，其中的糖含量為45.43％。因此，根據(jù)菌落和菌絲球的

5、形態(tài)學(xué)特征，可以對云芝菌種的性能進(jìn)行初步評估。
　　 將優(yōu)選云芝菌株P(guān)T00407制成種子液，采用碳氮總量為6.9％的優(yōu)化培養(yǎng)基在30L發(fā)酵罐中進(jìn)行液體發(fā)酵。在接種量10％，裝液量80％，初始轉(zhuǎn)速200rpm，通氣量0.5v/v/min的基礎(chǔ)上，采用四因素三水平正交設(shè)計對發(fā)酵液的pH、溶氧、培養(yǎng)溫度以及放罐時間等工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。研究結(jié)果表明，液體發(fā)酵的最佳組合為A1B2C3D3，即發(fā)酵液pH4、溶氧20％、培養(yǎng)溫度30℃、放罐