納豆激酶高產(chǎn)菌株的選育及液體發(fā)酵工藝優(yōu)化研究.pdf

1、納豆激酶(Nattokinase,NK)是由納豆芽孢桿菌[Bacill us subtilis(natto．var)]分泌產(chǎn)生的一種具有強烈纖溶作用的絲氨酸堿性蛋白酶。NK的纖溶機制為：①直接作用于交聯(lián)纖維蛋白，對纖維蛋白原不敏感，不易引起出血傾向；②能夠激活體內(nèi)t-PA，可以溫和、持續(xù)的發(fā)揮纖溶作用；③NK可水解纖溶酶原激活劑的1型抑制劑(PAI-1)，使其失活，PAI-1的失活可直接使纖溶作用增強。與目前臨床上常用的血栓治療藥物鏈激

2、酶(SK)、尿激酶(u-PA)、組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)等相比，納豆激酶具有溶栓效果明顯；不易引起出血，安全性能好；能抗胰酶水解，經(jīng)消化道吸收，不被破壞等優(yōu)點。因此，將納豆激酶開發(fā)成新型口服溶栓藥將具有廣泛的市場前景。 本研究采用誘變育種的方法選育納豆激酶高產(chǎn)菌株；以紫外、微波為單因素分別對出發(fā)菌株BN3撐6進行誘變，確定紫外誘變的最佳條件為40W紫外燈、30cm照射時間20s，此條件下致死率為98.4％、突變率0.7％

3、，該條件下誘變得到正突變株YSBN8、YSBN362；微波誘變最佳條件為菌懸液濃度10<'4>個/mL，作用時間5秒，此時致死率為99.2％，突變率為2.5％，該條件下得到正突變株YSBN411、YSBN467、YSBN484，YSBN497。相同培養(yǎng)條件下測得上述六突變株的產(chǎn)酶活性分別為出發(fā)菌株的128％、130％、118.7％，184.7％，143.3％和124.1％，其中YSBN467的固體發(fā)酵產(chǎn)酶活性為2200IU/g，是出發(fā)菌

4、株的1.84倍；對其連續(xù)傳代五次考察產(chǎn)酶能力差異，結果證明其遺傳性狀穩(wěn)定。同時，實驗還研究了誘變菌株的篩選方法——牛奶．瓊脂板法，該法在誘變選育納豆菌時能夠大大減少工作量，科學可行。 實驗還對瓊脂粉、纖維蛋白平板法、纖維蛋白平板法、瓊脂糖-纖維蛋白平板法測定納豆激酶活性的特點進行了比較研究；確定采用瓊脂粉-纖維蛋白平板法測定納豆激酶活性；該法具有溶圈明顯、易于測量、機械強度好、操作簡便、成本低等優(yōu)點，適用于納豆菌的選育及納豆激酶

5、發(fā)酵工藝優(yōu)化中對納豆激酶的測定，通過實驗確定該法的具體操作為：①瓊脂粉．纖維蛋白平板法Ⅰ：將自制纖維蛋白原溶液與1.2％瓊脂粉溶液分別置于55℃水浴中恒溫15min，等體積混合，迅速搖勻后倒平板，每板中倒入15mL；②瓊脂粉．纖維蛋白平板法Ⅱ：將自制纖維蛋白原溶液與等體積1.2％瓊脂粉溶液混合，共熱至沸，倒板。測定酶活的條件：取酶液10μl點板，25℃，放置16h，測量溶圈的垂直直徑并以直徑積表示溶圈面積。實驗確定該法的測定下限為55I

6、U/mL，精確測定范圍為326.6～2200(IU/mL)。本實驗研究了突變菌株YSBN467的最適液體發(fā)酵產(chǎn)酶條件，單因素考察后設計正交試驗，確定了該菌株的最適搖床發(fā)酵條件為：麥芽糖1％，大豆蛋白胨2％，CaCl<,2>、K<,2>HPO<,4>、KH<,2>PO<,4>各0.02％；接種量4％，溫度為30℃，初始pH為6.5，培養(yǎng)基裝液量為20mL(/100mL三角瓶)，接種量4％，搖床轉速為120r/min。在最適搖床發(fā)酵條件下，