RNA干擾熱休克蛋白27基因?qū)ψ园l(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的影響.pdf

1、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)是血管壁的主要組成成分，維系著血管壁的結(jié)構(gòu)和功能。VSMCs從中膜遷移到內(nèi)膜下對(duì)內(nèi)膜增厚程度及斑塊的形成和穩(wěn)定起至關(guān)重要的作用。內(nèi)膜增厚是血管對(duì)各種損傷，如動(dòng)脈粥樣硬化形成、支架植入及球囊擴(kuò)張等的反應(yīng)?？梢哉f沒有VSMCs的遷移，就沒有斑塊的形成。熱休克蛋白27(heat shock protein27，HSP27)屬于小分子熱休克蛋白( the sm

2、all heat shock protein，sHSP)家族中的重要一員，其重要的生物學(xué)功能是保護(hù)細(xì)胞免受環(huán)境中自由基、熱、缺血和毒性物質(zhì)等各種應(yīng)激因素導(dǎo)致的損傷，參與細(xì)胞的增殖分化、細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)及微絲的穩(wěn)定，是細(xì)胞遷移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。作為一種新的基因治療方法，RNA干擾(RNA interference，RNAi)以其特異性、高效性成為研究的熱點(diǎn)。慢病毒載體具有可感染分裂細(xì)胞及非分裂細(xì)胞、轉(zhuǎn)移基因片段容量較大、目的基因表達(dá)時(shí)

3、間長(zhǎng)、不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)前基因治療中理想載體。為此，我們利用RNAi干擾技術(shù)，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠HSP27基因的小干擾RNA片段，通過慢病毒轉(zhuǎn)染VSMCs，觀察其對(duì)VSMCs的增值及遷移作用的影響，以期為進(jìn)一步研究HSP27功能及基因治療奠定基礎(chǔ)。 本課題分為三部分。 第一部分：自發(fā)性高血壓大鼠HSP27基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定 從Genbank獲得HSP27基因序列。根據(jù)

4、HSP27 mRNA序列，設(shè)計(jì)、合成三對(duì)帶有BglⅡ、HindⅢ酶切位點(diǎn)、互補(bǔ)的靶向自發(fā)性高血壓大鼠HSP27基因RNAi片段。磷酸化后退火，插入PSUPER-basic載體，產(chǎn)生含H1啟動(dòng)子并能夠表達(dá)小發(fā)夾RNA(small hair，shRNA)的PSUPER-basic-HSP27載體質(zhì)粒，分別命名為：PSUPER-basic-HSP27-1、PSUPER-basic-HSP27-2、PSUPER-basic-HSP27-3。將構(gòu)

5、建的PSUPER-basic-HSP27行EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定。初步鑒定正確的質(zhì)粒載體送生物公司進(jìn)一步測(cè)序鑒定。將三對(duì)鑒定正確的PSUPER-basic-HSP27中的 HSP27 shRNA表達(dá)結(jié)構(gòu)進(jìn)行酶切，插入到慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pNL-IRES2-EGFP中，產(chǎn)生 pNL- HSP27-IRES2-EGFP。再將三質(zhì)粒pNL-HSP27-IRES2-EGFP，pHelper和VSVG共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生慢病毒。經(jīng)超

6、速離心收集病毒顆粒，轉(zhuǎn)導(dǎo)293T細(xì)胞，測(cè)定慢病毒的滴度。結(jié)果顯示：shRNA表達(dá)結(jié)構(gòu)成功的插入pNL--IRES2-EGFP質(zhì)粒，產(chǎn)生能同時(shí)表達(dá)EGFP和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生HSP27 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pNL- HSP27.-IRES2-EGFP-1、2、3。并包裝出高滴度的病毒。 第二部分：靶向自發(fā)性高血壓大鼠熱休克蛋白27基因的慢病毒對(duì)血管平滑肌細(xì)胞HSP27基因沉默作用 采用組織貼塊法分離、培養(yǎng)SHR胸主動(dòng)脈血管平滑

7、肌細(xì)胞，三天后，細(xì)胞伸出組織塊。兩周后，細(xì)胞呈典型的‘谷和峰’生長(zhǎng)模式。Alpha Smooth MuscleActin單克隆抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見胞漿內(nèi)呈棕黃色絲狀條紋，VSMCs陽性率為95％以上。以慢病毒感染VSMCs，然后使用Trizol抽提細(xì)胞總RNA，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RTQ-PCR)檢測(cè)VSMCs HSP27mRNA的表達(dá)水平；蛋白免疫印跡法(Westem-blo

8、tting，WB)檢測(cè)VSMCs HSP27蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示：RTQ-PCR顯示，三對(duì)互補(bǔ)片段均有不同程度的干擾效果，分別是：pNL-HSP27-IRES2-EGFP-1:0.774；pNL-HSP27-IRES2-EGFP-2:0.711；pNL-HSP27-IRES2-EGFP-3；0.43。Westem blot檢測(cè)顯示，HSP27蛋白質(zhì)條帶位于27kD位置，慢病毒感染的VSMCs細(xì)胞組HSP27蛋白表達(dá)水平明顯降低。以pN

9、L-HSP27-IRES2-EGFP-1組的干擾效率最高，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果相一致。 第三部分：干擾自發(fā)性高血壓大鼠熱休克蛋白27基因?qū)SMCs細(xì)胞增殖、遷移的影響 通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法和四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)VSMCs細(xì)胞增殖，使用AngII和PDGF-BB誘導(dǎo)VSMCs的HSP27磷酸化，用特異性的單克隆Phospho-HSP27抗體的蛋白免疫印跡法檢測(cè)HSP27的活性，以FITC-鬼筆環(huán)肽標(biāo)記F-ac

10、tin，用激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞骨架的形態(tài)變化，采用改良的Boyden微孔膜雙槽法進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示：pNL-HSP27-IRES2-EGFP-1可顯著抑制PDGF-BB、AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，抑制率分別為30.8％(P<0.05)和26.1％(P<0.05)。PDGF-BB和AngⅡ呈濃度依賴性誘導(dǎo)VSMCs的HSP27磷酸化，與對(duì)照組相比分別增加168.9％和198.9％(P<0.01)，同時(shí)使VSMCs內(nèi)F-acti

11、n數(shù)量明顯增加，縱向平行排列，形成應(yīng)力纖維絲。對(duì)AngⅡ、PDGF-BB誘導(dǎo)的HSP27磷酸化，pNL-HSP27-IRES2-EGFP-1抑制率分別是66.1％和79.6％(P<0.01)。pNL-HSP27-IRES2-EGFP-1能夠顯著抑制PDGF-BB、AngII誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞遷移，抑制率分別為45.6％和40.0％(P<0.01)。 結(jié)論： 1、成功構(gòu)建了能夠表達(dá)HSP27小干擾RNA慢病毒載體質(zhì)粒pN

12、L-HSP27-IRES2-EGFP。構(gòu)建的pNL-HSP27-IRES2-EGFP-1慢病毒載體能夠高效、特異的沉默HSP27基因的表達(dá) 2、pNL-HSP27-IRES2-EGFP-1顯著抑制AngⅡ、PDGF-BB誘導(dǎo)的HSP27磷酸化。pNL-HSP27-IRES2-EGFP-1特異、高效的沉默了HSP27基因，HSP27的表達(dá)顯著降低，從而使得AngⅡ、PDGF-BB誘導(dǎo)的HSP27磷酸化也相應(yīng)的明顯減少； 3