RNA干擾熱休克蛋白27基因對自發(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細胞增殖、遷移的影響.pdf

1、血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)是血管壁的主要組成成分，維系著血管壁的結構和功能。VSMCs從中膜遷移到內膜下對內膜增厚程度及斑塊的形成和穩(wěn)定起至關重要的作用。內膜增厚是血管對各種損傷，如動脈粥樣硬化形成、支架植入及球囊擴張等的反應?？梢哉f沒有VSMCs的遷移，就沒有斑塊的形成。熱休克蛋白27(heat shock protein27，HSP27)屬于小分子熱休克蛋白( the sm

2、all heat shock protein，sHSP)家族中的重要一員，其重要的生物學功能是保護細胞免受環(huán)境中自由基、熱、缺血和毒性物質等各種應激因素導致的損傷，參與細胞的增殖分化、細胞凋亡的信號轉導調節(jié)及微絲的穩(wěn)定，是細胞遷移的關鍵調節(jié)因子。作為一種新的基因治療方法，RNA干擾(RNA interference，RNAi)以其特異性、高效性成為研究的熱點。慢病毒載體具有可感染分裂細胞及非分裂細胞、轉移基因片段容量較大、目的基因表達時

3、間長、不易誘發(fā)宿主免疫反應等優(yōu)點，已成為當前基因治療中理想載體。為此，我們利用RNAi干擾技術，設計并合成針對自發(fā)性高血壓大鼠HSP27基因的小干擾RNA片段，通過慢病毒轉染VSMCs，觀察其對VSMCs的增值及遷移作用的影響，以期為進一步研究HSP27功能及基因治療奠定基礎。 本課題分為三部分。 第一部分：自發(fā)性高血壓大鼠HSP27基因RNAi慢病毒載體的構建與鑒定 從Genbank獲得HSP27基因序列。根據

4、HSP27 mRNA序列，設計、合成三對帶有BglⅡ、HindⅢ酶切位點、互補的靶向自發(fā)性高血壓大鼠HSP27基因RNAi片段。磷酸化后退火，插入PSUPER-basic載體，產生含H1啟動子并能夠表達小發(fā)夾RNA(small hair，shRNA)的PSUPER-basic-HSP27載體質粒，分別命名為：PSUPER-basic-HSP27-1、PSUPER-basic-HSP27-2、PSUPER-basic-HSP27-3。將構

5、建的PSUPER-basic-HSP27行EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定。初步鑒定正確的質粒載體送生物公司進一步測序鑒定。將三對鑒定正確的PSUPER-basic-HSP27中的 HSP27 shRNA表達結構進行酶切，插入到慢病毒轉移質粒pNL-IRES2-EGFP中，產生 pNL- HSP27-IRES2-EGFP。再將三質粒pNL-HSP27-IRES2-EGFP，pHelper和VSVG共轉染293T細胞，包裝產生慢病毒。經超

6、速離心收集病毒顆粒，轉導293T細胞，測定慢病毒的滴度。結果顯示：shRNA表達結構成功的插入pNL--IRES2-EGFP質粒，產生能同時表達EGFP和轉錄產生HSP27 shRNA的慢病毒轉移質粒pNL- HSP27.-IRES2-EGFP-1、2、3。并包裝出高滴度的病毒。 第二部分：靶向自發(fā)性高血壓大鼠熱休克蛋白27基因的慢病毒對血管平滑肌細胞HSP27基因沉默作用 采用組織貼塊法分離、培養(yǎng)SHR胸主動脈血管平滑

7、肌細胞，三天后，細胞伸出組織塊。兩周后，細胞呈典型的‘谷和峰’生長模式。Alpha Smooth MuscleActin單克隆抗體免疫細胞化學染色可見胞漿內呈棕黃色絲狀條紋，VSMCs陽性率為95％以上。以慢病毒感染VSMCs，然后使用Trizol抽提細胞總RNA，以實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RTQ-PCR)檢測VSMCs HSP27mRNA的表達水平；蛋白免疫印跡法(Westem-blo

8、tting，WB)檢測VSMCs HSP27蛋白表達水平。結果顯示：RTQ-PCR顯示，三對互補片段均有不同程度的干擾效果，分別是：pNL-HSP27-IRES2-EGFP-1:0.774；pNL-HSP27-IRES2-EGFP-2:0.711；pNL-HSP27-IRES2-EGFP-3；0.43。Westem blot檢測顯示，HSP27蛋白質條帶位于27kD位置，慢病毒感染的VSMCs細胞組HSP27蛋白表達水平明顯降低。以pN

9、L-HSP27-IRES2-EGFP-1組的干擾效率最高，與實時熒光定量PCR結果相一致。 第三部分：干擾自發(fā)性高血壓大鼠熱休克蛋白27基因對VSMCs細胞增殖、遷移的影響 通過細胞計數(shù)法和四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測VSMCs細胞增殖，使用AngII和PDGF-BB誘導VSMCs的HSP27磷酸化，用特異性的單克隆Phospho-HSP27抗體的蛋白免疫印跡法檢測HSP27的活性，以FITC-鬼筆環(huán)肽標記F-ac

10、tin，用激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞骨架的形態(tài)變化，采用改良的Boyden微孔膜雙槽法進行細胞遷移實驗。結果顯示：pNL-HSP27-IRES2-EGFP-1可顯著抑制PDGF-BB、AngⅡ誘導的細胞增殖，抑制率分別為30.8％(P<0.05)和26.1％(P<0.05)。PDGF-BB和AngⅡ呈濃度依賴性誘導VSMCs的HSP27磷酸化，與對照組相比分別增加168.9％和198.9％(P<0.01)，同時使VSMCs內F-acti

11、n數(shù)量明顯增加，縱向平行排列，形成應力纖維絲。對AngⅡ、PDGF-BB誘導的HSP27磷酸化，pNL-HSP27-IRES2-EGFP-1抑制率分別是66.1％和79.6％(P<0.01)。pNL-HSP27-IRES2-EGFP-1能夠顯著抑制PDGF-BB、AngII誘導的VSMCs細胞遷移，抑制率分別為45.6％和40.0％(P<0.01)。 結論： 1、成功構建了能夠表達HSP27小干擾RNA慢病毒載體質粒pN

12、L-HSP27-IRES2-EGFP。構建的pNL-HSP27-IRES2-EGFP-1慢病毒載體能夠高效、特異的沉默HSP27基因的表達 2、pNL-HSP27-IRES2-EGFP-1顯著抑制AngⅡ、PDGF-BB誘導的HSP27磷酸化。pNL-HSP27-IRES2-EGFP-1特異、高效的沉默了HSP27基因，HSP27的表達顯著降低，從而使得AngⅡ、PDGF-BB誘導的HSP27磷酸化也相應的明顯減少； 3