椒目質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究及椒目脂肪酸SFODLPME–GC測(cè)定方法的建立.pdf

1、目的：
　　通過(guò)研究椒目的質(zhì)量及其質(zhì)量控制方法，制訂有效評(píng)價(jià)椒目質(zhì)量的山西省地方標(biāo)準(zhǔn)，為椒目藥材質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)；建立一種綠色、快速的樣品前處理技術(shù)——漂浮有機(jī)液滴凝固液相微萃取(solidification of floating organic liquid-phase microextraction，SFODLPME）聯(lián)合氣相色譜（gas chromatography，GC）的測(cè)定方法，測(cè)定椒目中油酸、亞油酸、α-亞麻酸

2、、棕櫚酸及硬脂酸的含量，為多指標(biāo)控制椒目質(zhì)量提供一定的參考依據(jù)，也為中藥脂肪酸的測(cè)定提供一種新的方法。
　　方法：
　　1.本課題采用常規(guī)的生藥鑒別方法，查閱《中國(guó)植物志》、《中國(guó)高等植物圖鑒》、《中藥大辭典》等有關(guān)專(zhuān)著，對(duì)收集的10批椒目藥材進(jìn)行了基源鑒別、性狀鑒別、顯微鑒別及薄層鑒別，建立了椒目的定性鑒別方法。
　　參照2010版《中國(guó)藥典》（一部）附錄和2015版《中國(guó)藥典》第四部通則相關(guān)方法，對(duì)椒目藥材進(jìn)行常規(guī)

3、的檢查，包括雜質(zhì)、水分、灰分、酸不溶性灰分、重金屬、砷鹽及醇溶性浸出物，并制訂椒目雜質(zhì)、水分、灰分、酸不溶性灰分及醇溶性浸出物的限度。
　　采用單因素實(shí)驗(yàn)，比較了索氏法與超聲法提取脂肪油的提取率，考察了溶劑、料液比、提取時(shí)間，優(yōu)化了提取脂肪油的工藝，建立了椒目脂肪油的最佳提取方法；優(yōu)化了椒目脂肪酸甲酯化的條件；對(duì)色譜柱類(lèi)型、柱溫、檢測(cè)器溫度及進(jìn)樣口溫度進(jìn)行了考察，建立了α-亞麻酸的GC測(cè)定方法，測(cè)定了10批椒目中α-亞麻酸的含量；

4、制訂了脂肪油及α-亞麻酸含量的限度，建立了椒目的定量研究方法。
　　2.對(duì)SFODLPME的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，即有機(jī)溶劑的體積、鹽濃度、攪拌速度、萃取時(shí)間、供相體積，篩選出最佳的微萃取條件，優(yōu)化了色譜條件，建立SFODLPME–GC的含量測(cè)定方法，同時(shí)測(cè)定椒目中油酸、亞油酸、α-亞麻酸、棕櫚酸、硬脂酸的含量，并對(duì) SFODLPME-GC法與傳統(tǒng)液液萃取(Liquid- liquid extraction，LLE）-GC法α-亞麻酸

5、的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了比較。
　　結(jié)果：
　　1.本課題組收集的10批椒目均為蕓香科植物花椒Zanthoxylum bungeanum Maxim.的干燥成熟種子。卵圓形或類(lèi)圓形，直徑3～5 mm，表面具黑色光澤，外皮常脫落，脫落后呈網(wǎng)狀灰棕色或棕黑色紋理，富油性，氣香，味辛辣，為其性狀特征。以種皮表皮細(xì)胞、石細(xì)胞、內(nèi)種皮細(xì)胞（下皮細(xì)胞）、胚乳細(xì)胞、油滴等為主要顯微特征。采用硅膠G薄層板，以α-亞麻酸和椒目對(duì)照藥材為對(duì)照，以環(huán)己烷

6、-乙酸乙酯-乙酸（10:1:0.1）為展開(kāi)劑，以1％硫酸香草醛溶液為顯色劑，105℃顯色后，在日光下檢視，斑點(diǎn)清晰，重現(xiàn)性好。建立了椒目藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的性狀鑒別項(xiàng)、顯微鑒別項(xiàng)和薄層鑒別項(xiàng)。
　　脂肪油提取工藝優(yōu)選的條件為：采用超聲提取法，以石油醚為溶劑，料液比為1:8，超聲提取30 min。α-亞麻酸甲酯化優(yōu)選的條件為：0.5 mol·L-1氫氧化鉀甲醇溶液1 mL，60℃水浴加熱30 min；14%三氟化硼甲醇溶液1 mL，60℃

7、水浴加熱20 min。建立椒目α-亞麻酸含量的GC測(cè)定方法：采用聚乙二醇20000（PEG-20M）毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.5μm），在柱溫為190℃，檢測(cè)器溫度為250℃，進(jìn)樣口溫度為250℃的條件下，α-亞麻酸得到較好的分離；含量測(cè)定方法學(xué)研究表明，α-亞麻酸在0.3046～12.1840 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=0.4871X+0.0015，r=0.9999（n=6），平均回收率為1

8、00.65%。
　　10批椒目藥材樣品的雜質(zhì)含量1.08%～5.82%，含水量9.66%～11.55%，灰分含量5.13%～6.51%，酸不溶性灰分含量0.11%～0.56%，重金屬均在百萬(wàn)分之十以下，砷鹽均在百萬(wàn)分之二以下；以干燥品計(jì)，椒目中浸出物含量16.77%～24.80%，脂肪油含量19.82%～28.08%，α-亞麻酸含量4.06%～6.56%。
　　按照中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)限度制定原則，即最大（?。┲怠?0%，提出了椒目

9、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中雜質(zhì)含量不得過(guò)3%，水分含量不得過(guò)12.7%，總灰分含量不得過(guò)7.2%，酸不溶性灰分含量不得過(guò)0.6%；浸出物含量不得少于15.1%，脂肪油含量不得少于17.84%，α-亞麻酸含量不得少于3.65%。建立了椒目質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢查項(xiàng)和含量測(cè)定項(xiàng)。
　　建立了椒目藥材的山西省地方標(biāo)準(zhǔn)（已審核）及標(biāo)準(zhǔn)草案。
　　2. SFODLPME條件優(yōu)化結(jié)果：萃取溶劑正十二醇體積20μL，鹽濃度為10%，攪拌速度為700 r/min，萃

10、取時(shí)間為20 min，供相體積為6.0 mL。建立了SFODLPME-GC的測(cè)定方法，采用聚乙二醇20000（PEG-20M）毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.5μm），程序升溫，起始溫度170℃，以5℃/min速率升至190℃，保持10 min，再以5℃/min升溫至210℃，保持10 min，進(jìn)樣口溫度為250℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器溫度為250℃。含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明：油酸、亞油酸、α-亞麻酸、棕櫚酸、硬脂酸依次在8.37～9

11、9.12μg·mL-1、8.60～135.84μg·mL-1、1.62～161.68μg·mL-1、10.17～160.64μg·mL-1、10.13～120.00μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限1.2～1.6μg·mL-1；日內(nèi)精密度RSD＜6.43%；日間精密度RSD＜9.61%；椒目五個(gè)脂肪酸的回收率在90.18%～109.14%。
　　3批椒目藥材的含量測(cè)定結(jié)果：油酸含量為4.31%～5.52%，亞油酸含

12、量為3.32%～5.36%，α-亞麻酸含量為6.72%～7.81%，棕櫚酸含量為2.20%～3.41%，硬脂酸含量為0.22%～0.23%。
　　對(duì)SFODLPME-GC法與傳統(tǒng)LLE-GC法的椒目α-亞麻酸的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，按α＝0.05水準(zhǔn)，P＞0.05，表明兩種方法沒(méi)有顯著性差異，SFODLPME-GC法可用于椒目脂肪酸的測(cè)定。
　　結(jié)論：
　　1.通過(guò)對(duì)10批不同產(chǎn)地的椒目藥材進(jìn)行了基源鑒別、性狀鑒別