沙門氏菌脂肪酸分型的研究及快速診斷方法的建立.pdf

1、目的：沙門氏菌是國際公認(rèn)的危害最嚴(yán)重的食源性致病菌。傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測方法操作繁瑣，通常需時4～7天；在流行病學(xué)診斷中常用的沙門氏菌分子生物學(xué)分型方法，要在獲得可疑爆發(fā)菌株純培養(yǎng)物的基礎(chǔ)上進行，不僅消耗大，需時也較長，難以滿足食物中毒快速診斷及有效防控的需要。脂肪酸分型方法將甲基脂肪酸提取與靈敏的氣相色譜檢測法結(jié)合，通過分析微生物細(xì)胞膜上的磷脂脂肪酸的組成，來鑒定微生物的種屬、分析微生物的多樣性?；诖嗽黹_發(fā)的微生物鑒定自動化系統(tǒng)Sh

2、erlock MIS可比傳統(tǒng)方法最少提前24h出具鑒定結(jié)果，獲得的數(shù)據(jù)可直接應(yīng)用系統(tǒng)附帶的軟件進行基于菌株脂肪酸成分的聚類分析，大大縮短流行病學(xué)診斷所需時間，且操作簡便，特別適用于大通量標(biāo)本的分析。但是，現(xiàn)有的Sherlock數(shù)據(jù)庫中僅包含五種血清型沙門氏菌的脂肪酸數(shù)據(jù)，尤其是不包括我國流行的沙門氏菌脂肪酸成分的基礎(chǔ)資料，使得該系統(tǒng)在我國的應(yīng)用受到一定的限制。本研究選擇2005年～2007年河北省17個血清型的130株沙門氏菌分離株進行

3、脂肪酸分型研究，目的是建立適合我國沙門氏菌脂肪酸分型快速診斷的實驗條件和方法，探討我國沙門氏菌流行株的脂肪酸構(gòu)成特征，在提供我國沙門氏菌脂肪酸組成本底資料基礎(chǔ)上，補充和完善沙門氏菌脂肪酸數(shù)據(jù)庫，為在我國應(yīng)用Sherlock MIS進行沙門氏菌快速診斷提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.沙門氏菌脂肪酸分型快速診斷方法的建立：將豬霍亂沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株分別在TSBA培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)24h和TSA培養(yǎng)基+5％去纖維綿羊血35℃培養(yǎng)

4、24h兩種條件下培養(yǎng)，提取脂肪酸進行鑒定，分別與TSBA6和CLIN6數(shù)據(jù)庫匹配。另在培養(yǎng)條件固定前提下設(shè)置25mg～35mg、35mg～45mg、45mg～55mg三個取菌量組，分別在不同獲菌量條件下對豬霍亂標(biāo)準(zhǔn)株進行脂肪酸提取和鑒定。實驗各重復(fù)十次，確立沙門氏菌脂肪酸分型鑒定的最佳培養(yǎng)條件及最佳獲菌量范圍。應(yīng)用建立的方法對130株沙門氏菌及130株非沙門氏菌進行脂肪酸分型鑒定，評價方法的準(zhǔn)確性、特異性、重復(fù)性。
　　 2.沙

5、門氏菌脂肪酸分型研究：應(yīng)用建立的方法對2005年～2007年河北省17個血清型的130株沙門氏菌分離株進行脂肪酸組成及含量分析，提供我國沙門氏菌流行株特征脂肪酸組成數(shù)據(jù)，評價脂肪酸分型方法對沙門氏菌的分型能力。
　　 3.脂肪酸分型與脈沖場凝膠電泳分型（PFGE）方法在食物中毒流行病學(xué)診斷上的應(yīng)用比較：同時應(yīng)用兩種分型方法對17株分離于一起沙門氏菌食物中毒的可疑爆發(fā)株及10株非相關(guān)的沙門氏菌分離株進行菌株同源性分析。比較方法間優(yōu)

6、劣，探討脂肪酸分型方法在流行病學(xué)診斷上的應(yīng)用前景。
　　 結(jié)果：應(yīng)用TSBA培養(yǎng)基進行細(xì)菌的分離培養(yǎng)和控制獲菌量為40mg，進行沙門氏菌脂肪酸分型，對沙門氏菌鑒定的準(zhǔn)確性達(dá)92.3％，特異性為100％，重復(fù)性為90％。以此作為標(biāo)準(zhǔn)參考方法對17個血清型的130株沙門氏菌分離株進行脂肪酸分析，共得到19種不同脂肪酸成分，其中所有菌株都含有的脂肪酸成分有12種，占優(yōu)勢的脂肪酸成分為：12：0、14：0、16：0、17：Ocyclo、

7、SumInFeature2、SumInFeature3，SumInFeature8，較Sherlock數(shù)據(jù)庫多了14：02OH、17：0、18：0、18：1ω9c。不同血清型沙門氏菌共有脂肪酸成分非常接近，僅有1～2種脂肪酸成分的差異。本次檢測的腸炎沙門菌分離株具有另外四種共有成分13：0、16：1ω5c、14：02OH、18：1ω9c；豬霍亂沙門菌具有另外兩種共有成分16：1ω5c、18：1ω9c，而缺少了19：Oiso。本實驗中腸炎

8、沙門菌17：0含量低于數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，而18：0含量遠(yuǎn)高于庫中值；豬霍亂沙門菌17：Ocyclo含量遠(yuǎn)低于數(shù)據(jù)庫數(shù)值，而18：0含量高于庫中值。同時運用PFGE和脂肪酸分型方法進行菌株同源性分析結(jié)果顯示，在小樣本暴發(fā)資料的研究中脂肪酸分型方法能夠反映菌株之間的親緣關(guān)系，聚類結(jié)果與脈沖場分型總體一致。但在菌株同源性判斷的精確性上與細(xì)菌分型“金標(biāo)準(zhǔn)”PFGE還有差距。
　　 結(jié)論：
　　 1.優(yōu)化了細(xì)菌脂肪酸分析分型的實驗條件，

9、建立了沙門氏菌脂肪酸分型標(biāo)準(zhǔn)參考方法。使用TSBA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24h，控制獲菌量在40mg（35～45mg），獲得的沙門氏菌的脂肪酸數(shù)據(jù)與Sherlock數(shù)據(jù)庫匹配最佳，鑒定結(jié)果最準(zhǔn)確。在此基礎(chǔ)上建立的沙門氏菌脂肪酸分型快速診斷方法可通過單次實驗較準(zhǔn)確地將沙門氏菌鑒定到種。
　　 2.提供了我國沙門氏菌流行株脂肪酸組成本底資料，補充和完善了Sherlock沙門氏菌脂肪酸數(shù)據(jù)庫。
　　 3.通過與脈沖場分型方法比較，