重組中性植酸酶phy(ycD)的表達(dá)及其性質(zhì).pdf

1、植酸是豆類、谷類和油料作物等種子中磷的主要儲存形式，植酸酶能夠水解植酸生成無機(jī)磷和磷酸肌醇衍生物，在動物飼料中添加植酸酶可以有效地提高植酸中磷的利用效率、降低動物排泄物的環(huán)境磷污染，并能通過去除植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用來提高飼料的營養(yǎng)價(jià)值，對具有高比活和良好熱穩(wěn)定性植酸酶的需求，促進(jìn)了酶資源的開發(fā)利用以及植酸酶基因工程和蛋白質(zhì)工程研究，也為更好應(yīng)用于實(shí)踐生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　 中性植酸酶也稱β-螺旋槳植酸酶，主要來源于芽孢桿菌，是耐熱性較

2、好，最適反應(yīng)pH呈中性(pH7.0-7.5)，能夠分解植酸釋放磷元素，并且與金屬離子有關(guān)的一類酶，尤其是Ca2+對于植酸酶酶活性及穩(wěn)定性起到至關(guān)重要的作用。這一類植酸酶可在鯉科魚類及單胃動物等pH值呈中性的腸道中起作用，而酸性植酸酶在中性pH條件下活性基本喪失，這也彌補(bǔ)了酸性植酸酶性質(zhì)上的不足，提高植酸酶在動物胃腸道的效用，拓寬植酸酶的應(yīng)用范圍。課題組前期從毛豆根部土壤中篩選到兩株產(chǎn)植酸酶的芽孢桿菌，克隆了兩個(gè)中性植酸酶基因phy(yc

3、D)和phy(ycE)，構(gòu)建了中性植酸酶原核表達(dá)基因工程菌，本研究將phy(ycD)基因連接到帶有T71ac啟動子的pET-28a(+)表達(dá)載體上，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-phy(ycD)，并在大腸桿菌BL21(DE3)中用IPTG在16℃下進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，利用Ni-NAT親和層析的方法純化獲得的融合蛋白r-phy(ycD)，經(jīng)SDS-PAGE分析和表達(dá)產(chǎn)物的研究表明:經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的酶蛋白幾乎以可溶的形式存在，占可溶性蛋白

4、的40％以上，包涵體很少，純化后蛋白純度達(dá)90％以上，在SDS-PAGE膠上顯示大小為～45kDa的條帶，測定酶活表明表達(dá)產(chǎn)物具有酶活性。
　　 對純化后的植酸酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，該酶最適Ca2+濃度為1mM，其酶促反應(yīng)的最適pH為6.5，最適反應(yīng)溫度為45℃，Km值和Vmax值分別為0.213mM和92.6nmolmg-1proteins-1。在65℃、pH6.5和濃度為1mMCa2+條件下處理20min，與37℃時(shí)相比，殘

5、余酶活為30％;在pH6.5、37℃和濃度為1mMCa2+條件下處理1h，殘余酶活為60％;在60℃、pH6.5條件下孵育不同的時(shí)間，10mMCa2+濃度酶蛋白明顯比0、1和5mMCa2+濃度酶蛋白的熱穩(wěn)定性好;該酶是Ca2+依賴性酶，1.0mMCa2+能顯著提高酶蛋白的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，EDTA、Zn2+、Ba2+和Fe2+對酶促反應(yīng)均有顯著抑制作用。
　　 綜上所述，r-phy(ycD)酶學(xué)性質(zhì)預(yù)示其在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用