重組AiiA蛋白表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、革蘭氏陰性細(xì)菌是主要的植物致病菌,而其致病菌主要是通過細(xì)菌的群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)系統(tǒng)來調(diào)控其致病因子的表達(dá),而N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-acyl-homoserine lactones,AHL)是QS系統(tǒng)的關(guān)鍵信號(hào)分子,當(dāng)AHL在相對(duì)封閉的環(huán)境中不斷積累,其濃度到一定閾值時(shí)就能夠激活QS系統(tǒng)的致病因子的啟動(dòng)子,促進(jìn)致病因子的表達(dá),產(chǎn)生致病性并出現(xiàn)相關(guān)癥狀。因此降低AHL的濃度成為防治這類病害的關(guān)鍵。蘇云金芽孢桿

2、菌中的aiiA基因表達(dá)的AriA蛋白能夠水解AHL內(nèi)酯環(huán),降低相對(duì)封閉環(huán)境中的AHL的量,從而降低AHL的濃度,能阻滯甚至破壞革蘭氏陰性細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng),從而達(dá)到控制革蘭氏陰性細(xì)菌病害的目的,有望成為生物防治革蘭氏陰性病原菌的一種生物防治的新手段。
　　 采用不同發(fā)酵培養(yǎng)基及誘導(dǎo)條件對(duì)重組工程菌E.coli-BL21(DE3)-pET29a-aiiA表達(dá)可溶性AiiA蛋白的影響做了分析。確定了E.coli-BL21(DE3)-

3、pET29a-aiiA最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,表達(dá)條件優(yōu)化表明,在250ml的三角錐形瓶中裝70ml的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液,培養(yǎng)液中加入20 mmol/L Na2HPO4,pH值為7.0,在對(duì)數(shù)生長初期(OD600為0.5)用濃度為0.6 mmol/L IPTG誘導(dǎo)20h時(shí),可溶性的AliA蛋白相對(duì)表達(dá)量最高,達(dá)到4.54 mg/mL,占總的目的蛋白相對(duì)含量的60.3％?？扇苄訟iiA蛋白的高效表達(dá)為后續(xù)研究,如進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)的

4、相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 重組工程菌E.coli BL21(DE3)-pET29a-aiiA培養(yǎng)誘導(dǎo)之后,破壁收集表達(dá)的可溶性AiiA蛋白,純化后對(duì)其進(jìn)行酶學(xué)特性的研究。研究表明該酶催化反應(yīng)的最適溫度為28℃,反應(yīng)最適pH為6.5；AliA蛋白酶對(duì)溫度比較敏感,在28℃下保溫30min酶活力還保持在81.8％左右,但是當(dāng)在37℃下保溫30min后急劇下降到19.1％,當(dāng)在45℃下保溫30min之后酶活基本喪失；AiiA蛋白酶在4

5、℃冰箱儲(chǔ)存24h后剩余酶活還維持在85％以上。當(dāng)儲(chǔ)存96h剩余酶活大概為20％,當(dāng)儲(chǔ)存120h后基本喪失酶活；以AHL底物濃度(S)分別為0.4mmol/L、0.6mmol/L.0mmol/L、2.0mmol/L時(shí)測(cè)定AiiA在pH值為6.5、28℃下酶促反應(yīng)的初速度(V0),以1/[S]對(duì)1/V0做Lineweaver-Burk圖,擬合直線,得出AiiA酶水解AHL的Km和Vmax分別為:1.25mmol/L和25umol/L/min

6、。對(duì)AiiA蛋白的酶學(xué)特性進(jìn)行研究,不僅可以為進(jìn)一步研究該酶的結(jié)構(gòu)與功能、比較不同來源生物的酶學(xué)差異提供有益的數(shù)據(jù),而且為今后探索AiiA蛋白的作用機(jī)理奠定理論基礎(chǔ),為改造AiiA蛋白的結(jié)構(gòu)特性提供了理論依據(jù)。
　　 AiiA蛋白最適作用溫度及其熱穩(wěn)定性直接影響其在實(shí)踐中的應(yīng)用范圍。為了能夠?qū)iiA蛋白應(yīng)用范圍擴(kuò)大并最終實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用,有必要對(duì)AiiA蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造,提高其熱穩(wěn)定性,使其更能適應(yīng)外界自然環(huán)境并發(fā)揮作用。對(duì)

7、AiiA蛋白的第57位、62位、65位、195位、206位氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變。第57位氨基酸由原來的Ala突變成Pro;第62位的氨基酸由原來的Gly突變?yōu)锳la；第65位氨基酸由原來的ASh突變?yōu)長ys；第195位氨基酸由原來的Thr突變?yōu)锳sp；第206位氨基酸由原來的Ala突變?yōu)镚lu。突變結(jié)果表明,AiiA-65-12、AiiA-195-12及AiiA-206-6酶活力均有一定程度的提高,其中AiiA-206-6最適作用溫度為3

8、7℃,同野生型的28℃相比,最適反應(yīng)溫度提高了9℃,AiiA-206-6最適作用溫度提高,可能是由于帶負(fù)電強(qiáng)的極性氨基酸Glu增強(qiáng)了AiiA蛋白與Zn+的結(jié)合力,提高了酶活力中心的穩(wěn)定性；AiiA-65—12在37℃下保溫30min酶活力還保持90％左右,相對(duì)于野生型AiiA蛋白酶的19.1％有了顯著的提高；AiiA-195-12在4℃儲(chǔ)存過程中酶活降低的速度比較均勻,沒有出現(xiàn)急劇的下降過程,說明酶的穩(wěn)定性有了一定的提高。AiiA-65