分子氫對(duì)心肌缺血再灌注損傷保護(hù)的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景
　　 隨著國(guó)民生活水平的提高，冠心病的發(fā)病率日趨升高。在冠心病的治療中，缺血心肌再血管化是目前最重要的手段；而再血管化過(guò)程中，心肌缺血再灌注損傷一直是臨床醫(yī)生無(wú)法回避的難題。
　　 目前的觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為：心肌缺血再灌注損傷過(guò)程主要涉及：自由基的大量生成、心肌細(xì)胞鈣超載、中性粒細(xì)胞激活、細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜液態(tài)性、流動(dòng)性降低及通透性的升高等一系列的損傷過(guò)程。其中尤以自由基生成增多在缺血再灌注損傷中的作用最為引人關(guān)注。自由基

2、是含有未成對(duì)電子的原子、原子團(tuán)或分子，是維持正常生命所必需的物質(zhì)。自由基反應(yīng)是能量代謝的基礎(chǔ)，部分自由基是細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)分子，而另一部分自由基則是生物大分子、細(xì)胞的危險(xiǎn)殺手。生理情況下，體內(nèi)自由基不斷產(chǎn)生，也不斷被清除，使之維持在一個(gè)正常水平上，自由基過(guò)多或過(guò)少均會(huì)給機(jī)體造成不利影響甚至傷害。生物體內(nèi)自由基類(lèi)型有很多，研究比較多的是氧自由基和氮自由基。氧自由基包括超氧陰離子、單線(xiàn)態(tài)氧和羥自由基，因過(guò)氧化氫在生物學(xué)作用上與氧自由基類(lèi)似，常

3、把氧自由基和過(guò)氧化氫共稱(chēng)為活性氧。比較重要的氮自由基有一氧化氮和過(guò)氧亞硝基陰離子。在生物體內(nèi)的自由基中，羥自由基和過(guò)氧亞硝基陰離子的毒性最強(qiáng)，是導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷的重要介質(zhì)。
　　 盡管對(duì)再灌注損傷的抗氧化劑治療一直以來(lái)都是研究的熱點(diǎn)，但臨床上迄今為止尚未找到可以有效治療心肌缺血再灌注損傷的抗氧化藥物。當(dāng)缺血或炎癥發(fā)生時(shí)，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量各類(lèi)活性氧，在這些活性氧中，過(guò)氧化氫和一氧化氮等具有重要的信號(hào)作用、毒性作用很弱，而羥自由基和過(guò)

4、氧亞硝基陰離子毒性強(qiáng)，是導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷的主要介質(zhì)。過(guò)去治療氧化損傷的研究思路是尋找足夠強(qiáng)的還原性物質(zhì)。但是，還原性太強(qiáng)，必然導(dǎo)致內(nèi)源性氧化還原狀態(tài)的失衡，甚至成為抗氧化治療無(wú)效的關(guān)鍵原因。
　　 因此，尋找一種療效確切且具有選擇性抗氧化功能的藥物是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。
　　 2007年有學(xué)者在《nature medicine 》報(bào)道，呼吸2％氫可通過(guò)選擇性清除氧自由基治療腦缺血再灌注損傷。國(guó)內(nèi)外隨后有學(xué)者證明呼吸氫對(duì)動(dòng)脈硬

5、化、腦、肝缺血再灌注損傷具有治療作用。相對(duì)于以往的抗氧化劑，氫的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)在于其可以選擇性清除再灌注損傷過(guò)程中毒性最大的兩種自由基－羥自由基和過(guò)氧亞硝基陰離子。
　　 研究目的
　　 本課題擬采用經(jīng)典的心肌缺血再灌注模型，研究腹腔注射氫飽和生理鹽水對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及具體機(jī)制，為氫治療心肌缺血再灌注損傷提供在體證據(jù)，推動(dòng)氫生物學(xué)研究的深入開(kāi)展，同時(shí)為臨床上治療心肌缺血再灌注損傷提供新的思路和方法。
　

6、　 研究方法
　　 SD大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組（對(duì)大鼠僅實(shí)施開(kāi)胸手術(shù)），對(duì)照組（通過(guò)結(jié)扎左心前降支造成心肌缺血，半小時(shí)后松結(jié)，再灌注24小時(shí)），實(shí)驗(yàn)組（心肌再灌注之前5分鐘腹腔注射氫飽和生理鹽水，其他同對(duì)照組）。采用經(jīng)典的心肌缺血再灌注模型建立方法，手術(shù)后24小時(shí)檢測(cè)心功能指標(biāo)及再灌注后心肌梗死面積，掃描電鏡觀(guān)察保存后心肌組織超微結(jié)構(gòu)損傷程度，顯微鏡下觀(guān)察中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，ELISA 法檢測(cè)不同組別間心肌組織的TNF-a，I

7、L-1b和MPO水平變化，免疫組化方法測(cè)定不同組別間3-硝基酪氨酸、8-羥基脫氧鳥(niǎo)嘌呤和粘附分子ICAM-1含量，Tunel 染色測(cè)定心肌細(xì)胞凋亡率以及熒光分光光度法檢測(cè)caspase-3 活性。
　　 研究結(jié)果
　　 （1）實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠的心功能較假手術(shù)組均有明顯的下降（P＜0. 05)。但相對(duì)于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的心功能下降程度明顯減輕（P＜0. 05)。證明分子氫對(duì)再灌注后心功能有明顯的保護(hù)作用。
　　 （

8、2）實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)比較假手術(shù)組均有不用程度的損害。相對(duì)于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損害程度較輕。證明分子氫對(duì)再灌注后心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)有明顯的保護(hù)作用。
　　 （3）相對(duì)于假手術(shù)組，對(duì)照組的大鼠心肌TNF-a、IL-1b、ICAM-1、MPO水平和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)有明顯的升高(P<0.05)，而在實(shí)驗(yàn)組中，這種升高程度得到有效的緩解(P<0.05)。說(shuō)明分子氫可以有效減輕缺血再灌注過(guò)程中的炎癥反應(yīng)。
　　

9、 （4）對(duì)照組的3-硝基酪氨酸、8-羥基脫氧鳥(niǎo)嘌呤水平與假手術(shù)組相比有明顯升高(P<0.05)，而實(shí)驗(yàn)組3-硝基酪氨酸、8-羥基脫氧鳥(niǎo)嘌呤的水平雖然也升高，但比較對(duì)照組則明顯降低(P<0.05)，說(shuō)明分子氫可以有效降低缺血再灌注過(guò)程中的氧化應(yīng)激反應(yīng)，并中和毒性較強(qiáng)的羥自由基和過(guò)氧亞硝基陰離子。
　　 （5）分別用TUNEL 試劑盒及熒光分光光度法檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡狀況及caspase-3 活性，結(jié)果顯示：對(duì)照組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量

10、及caspase-3 活性顯著高于實(shí)驗(yàn)組 (P<0.05)，證明分子氫在缺血再灌注過(guò)程中有顯著的抗凋亡作用。
　　 研究結(jié)論
　　 （1）氫飽和生理鹽水對(duì)心肌缺血再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用，可以有效緩解再灌注后心肌收縮功能的減低，改善血流動(dòng)力學(xué)。
　　 （2）氫飽和生理鹽水可以有效減輕缺血再灌注后心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷，保護(hù)心肌細(xì)胞。（3）實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組TNF-a、IL-1b、ICAM-1、MPO 含量和中性粒細(xì)